Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Zabieg chirurgiczny
Uwaga: 20 samcom szczurów Sprague-Dawley wstrzyknięto mikroiniekcję złożonego białka beta amyloidu (Aβ) do komory bocznej i przednio-grzbietowego jądra wzgórza i oznaczono jako grupę potraktowaną Aβ. Kolejne 20 szczurów poddano tej samej operacji, ale otrzymano 0,1% mikroiniekcji soli fizjologicznej z dimetylosulfotlenku (DMSO) i wyznaczono je jako grupę pozorowaną.
- Znieczulij szczury 100% izofluranem przez wdychanie, a następnie przytrzymuj je na aparacie stereotaktycznym mózgu.
- Ogol futro na czubku głowy nożyczkami chirurgicznymi i zdezynfekuj jodoforem. Następnie przykryj głowę jednorazowym ręcznikiem chirurgicznym.
- Wykonaj nacięcie na skórze głowy wzdłuż środkowej podłużnej kalwarii za pomocą biszkoptów chirurgicznych i nożyczek.
- Oddziel tkankę podskórną i powięź, przetrzyj czaszkę calvarium sterylną suchą bawełną, aby zatrzymać krwawienie, i zaznacz bregmę markerem.
- Zapoznaj się z mapą stereotaktyczną mózgu szczura, biorąc pod uwagę bregmę jako punkt początkowy, zaznacz trzy punkty, jądro przednio-grzbietowe wzgórza (ad) (tylne (P): 2,0 mm do bregmy; boczne (L): 1,4 mm do linii środkowej) do wstrzykiwania rekombinowanego ludzkiego transformującego czynnika wzrostu-β1 (RHTGF-β1) i mocowania jednej, obszar bocznej komory (LV) (tylny (P): 0,8 mm do bregmy; boczna (L): 2,0 mm do linii środkowej) do wstrzykiwania białka beta amyloidu 25-35 (Aβ25-35) i trichlorku glinu (AlCl3) oraz drugie miejsce mocowania śrubą (przód (F): 2,0 mm do bregmy; boczne (L): 1,5 mm do linii środkowej).
- Delikatnie wywierć trzy otwory o średnicy 1 mm za pomocą elastycznego wiertła do kości wyznaczonego w powyższych trzech punktach czaszki (1,5. krok). Nie wkręcaj głębiej niż to konieczne, aby uniknąć dźgnięcia tkanki mózgowej.
- Zatamować krwawienie i kilkakrotnie czyścić powierzchnię czaszki sterylną, suchą bawełną.
- Wbić igłę połączoną z pompką do mikroiniekcji do mózgu na głębokości 4,6 mm i delikatnie wstrzyknąć 1 μl RHTGF-β1 (10 ng) w obszar reklamy. Pozostawić igłę na 2 minuty po wstrzyknięciu i powoli wyciągnąć igłę.
- Wkręć dwie w czaszkę, wyznaczone w punktach reklamy, oraz w drugie miejsce mocowania czaszki (które było wyznaczone w 1,5. kroku) za pomocą małego śrubokręta. Nie wkręcaj głębiej niż to konieczne, aby uniknąć dźgnięcia tkanki mózgowej.
- Zmontuj system implantacji kaniuli i włóż atrapę kaniuli do kaniuli prowadzącej po dezynfekcji pod wysokim ciśnieniem.
- Włóż kaniulę prowadzącą rurkę ze stali nierdzewnej do mózgu na 4,6 mm do obszaru lewej komory przez otwór czaszki za pomocą uchwytu kaniuli aparatu stereotaktycznego szczurów.
- Wymieszaj materiał bazowy protezy z wodą na podłożu protezy w proporcji 1,5 g na 1 ml, nałóż pastę na plastikowy cokół kaniuli prowadzącej i dwie, aby unieruchomić kaniulę prowadzącą i zakryj całe nacięcie skóry, aby uniknąć infekcji skóry.
- W drugim dniu operacji szczury zostały znieczulone inhalacją izofluranu za pomocą urządzenia do znieczulania małych zwierząt. Wyciągnij atrapę kaniuli, włóż kaniulę wewnętrzną do kaniuli prowadzącej i przykręć mocującą, aby unieruchomić kaniulę wewnętrzną.
- Ustawić rurkę polietylenową, która łączy pompę do mikroiniekcji z wewnętrzną kaniulą i wyregulować prędkość wtrysku do 1 μl/min. Mikrowstrzyknąć Aβ25-35 lub AlCl3 do LV.
- Mikrowstrzykiwać 4 μg (1 μL) Aβ25-35 dziennie przez 14 dni rano i 3 μL AlCl3 (1%) dziennie przez 5 dni po południu w znieczuleniu izofluranowym.
- Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać 5 minut, delikatnie wyciągnąć kaniulę wewnętrzną i ponownie włożyć atrapę kaniuli do kaniuli prowadzącej.
- W 15 dobie po operacji (co odpowiada ostatniemu dniu iniekcji Aβ25-35), zdemontuj system implantacji kaniuli. Delikatnie usuń materiał podstawy protezy za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy, odkręć dwie, wyciągnij kaniulę prowadzącą i zdezynfekuj ranę betadyną. Wypełnij otwór czaszki cementem kostnym i zszyj skórę prostą metodą szwu przerywanego.
- Wykonaj tę samą operację z grupą pozorowaną i wstrzyknij 0,1% soli fizjologicznej DMSO.
