$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Ścieranie podkładki pod stopę myszy
- Znieczulij mysz C57BL/6 (w wieku 5–7 tygodni) znieczuleniem gazowym izofluranem, podawanym w dawce 3% przez mały system (komorę) znieczulający.
- Umieść mysz w chirurgicznej płaszczyźnie znieczulenia na plecach, przed zaszczepieniem, w tylnej opuszki stopy. Przymocuj stożek nosowy z membraną (szczelina wystarczająco duża, aby pasowała do pyska zwierzęcia) do myszy i podawaj znieczulenie izofluranem w stałej dawce 1,5%-2,0%.
- Uważnie monitoruj mysz pod kątem reakcji na bolesny bodziec wywołany silnym szczypnięciem palca u nogi kleszczami.
- Lekko chwyć jedną tylną poduszkę stopy płaskimi kleszczami.
- Delikatnie zetrzyj nagą skórę tylnej poduszki stopy około 20 razy, między piętą a poduszkami do chodzenia, za pomocą szmergla (ziarnistość 100–180). Nie wywoływać krwawienia poprzez zbyt częste ścieranie lub wywieranie zbyt dużego nacisku.
- Za pomocą cienkich kleszczyków powoli oderwij warstwę rogową naskórka oderwaną przez ścieranie, aby odsłonić warstwę podstawną.
2. Szczepienie opuszki PRV
- Przygotować inokulum wirusa rozcieńczone do pożądanego miana w pożywce DMEM zawierającej 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (tabela materiałów).
- Określ ilościowo liczbę jednostek tworzących blaszki (PFU) w zapasie wirusa na komórkach PK15, aby obliczyć i ustandaryzować dawkę wirusa i odpowiednio rozcieńczyć inokulum wirusa.
nuta: W tym badaniu zastosowano zjadliwy szczep PRV (PRVBecker) w dawce 8 x 106 PFU. Dawka ta została zoptymalizowana w poprzednim wstępnym eksperymencie, aby upewnić się, że wszystkie zaszczepione zwierzęta wykazywały objawy kliniczne po 82 godzinach od inokulacji (hpi).
- Utrzymuj inokulum wirusa na lodzie i delikatnie wymieszaj przed użyciem.
- Dodać 20 μl kropli inokulum wirusa (8 x 106 PFU) na startą opuszkę stopy (podanie miejscowe). Przeprowadzać szczepienia próbne (tylko pożywka) równolegle.
- Delikatnie przetrzyj 10x trzonkiem igły, aby ułatwić adsorpcję wirusa. Unikać drapania czubkiem igły. Powtarzaj ten krok co 10 minut.
- Trzymaj mysz w znieczuleniu przez 30 minut, aż starta podkładka wyschnie.
- Po przerwaniu znieczulenia monitoruj mysz, aż będzie w stanie utrzymać leżącą mostek i umieść ją w indywidualnej klatce w celu obserwacji klinicznej i pobrania próbek.