Badanie akumulacji alfa-synukleiny w pierwotnych embrionalnych mysich neuronach dopaminowych

Abstract

Źródło: Er, S. et al., Badanie akumulacji α-synukleiny wywołanej przez wstępnie uformowane fibryle w pierwotnych embrionalnych neuronach dopaminowych śródmózgowia myszy.J. Vis. Exp. (2020).

Ten film pokazuje proces ilościowego określania akumulacji alfa-synukleiny w embrionalnych mysich neuronach dopaminowych wstępnie potraktowanych wstępnie uformowanymi włókienkami alfa-synukleiny. Przedstawia etapy utrwalania, barwienia i ilościowego oznaczania neuronów dopaminowych zawierających agregaty alfa-synukleiny za pomocą immunofluorescencji.

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Przygotowanie

1. Przygotuj pożywkę neuronów dopaminowych (DPM) z 0,46% D-glukozy, 1% L-glutaminy, 1% N2, 0,2% prymocyny, uzupełnioną DMEM/F12. Przefiltruj DPM po wymieszaniu składników. Przechowywać DPM w temperaturze 4 °C i ogrzać każdą porcję tylko raz.
   nuta: DPM nie powinien zawierać neurotroficznego czynnika glejowego (GDNF), ponieważ zmniejszy on akumulację α-synukleiny w neuronach dopaminowych.
2. Przygotuj pipety ze szkła silikonowanego, które są wyjątkowo hydrofobowe, minimalizując w ten sposób przyleganie do powierzchni i utratę komórek podczas początkowego obchodzenia się z neuronami embrionalnymi.
   1. Dodać 10 ml płynu silikonowego do 1 litra wody destylowanej i wymieszać, mieszając w naczyniu o pojemności 2 litrów. Szklane pipety należy pozostawić zanurzone w roztworze silikonowym na 15 minut.
   2. Przepłucz pipety 3–5 razy wodą destylowaną. Suszyć pipety przez noc w temperaturze pokojowej (RT) lub przez 1–2 godziny w sterylnym pomieszczeniu ogrzewanym w temperaturze 100-120 °C, aby przyspieszyć suszenie.
   3. Sterylizuj pipety w standardowym autoklawie w szczelnie zamkniętej torbie do autoklawu.
3. Przygotować 96-dołkowe płytki pokryte poli-L-ornityną (PO) z przezroczystym dnem, dodając 60 μl roztworu PO do środkowych dołków płytki 96-dołkowej, która ma być użyta do wysiewu neuronów, pozostawiając co najmniej jeden rząd/kolumnę studzienek na krawędziach płytki, aby uniknąć efektów krawędziowych. Powlekaną płytkę należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C lub 4 godziny w temperaturze pokojowej.
4. Przed posiewem komórek należy całkowicie odessać PO i trzykrotnie umyć komórki 100 μl 1x soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS). Zassać 1x PBS z dołków i pozostawić pokrywę płytki otwartą do całkowitego wyschnięcia.
   nuta: Możliwe jest zebranie zużytego zamówienia zakupu i przefiltrowanie go do ponownego wykorzystania. Można to powtórzyć dwukrotnie dla tego samego rozwiązania PO.
5. Dodać 50 μl DPM do wcześniej pokrytych studzienek. Odessać DPM ze studzienek za pomocą plastikowej końcówki o pojemności 100 μl i jednocześnie zarysować dno studzienki okrężnymi ruchami, aby usunąć powłokę na obwodzie każdej studzienki. Na środku studni pozostanie wyspa pokryta PO.
6. Pod pokrywą laminarną dodaj 10 μl DPM na środek każdej powlekanej wyspy, aby utworzyć mikrowyspy.
   nuta: Płytka z mikrowyspami pokrytymi DPM może być przechowywana pod okapem z przepływem laminarnym przez 1–2 godziny podczas izolacji komórek.

2. Izolacja brzusznego dna śródmózgowia od zarodków myszy E13.5

UWAGA: Patrz Rysunek 1, aby zapoznać się z etapami sekcji dna śródmózgowia.

1. Przed rozbieraniem należy napełnić 10-centymetrową szalkę Petriego buforem Dulbecco i trzymać ją na lodzie.
2. Poddaj eutanazji ciężarną samicę myszy E13.5 zgodnie z wytycznymi instytucji. Połóż mysz płasko na plecach i spryskaj przednią część ciała 70% etanolem. Podnieś skórę nad macicą za pomocą kleszczy i wykonaj nacięcie nożyczkami chirurgicznymi, aby odsłonić macicę.
3. Ostrożnie wyjmij macicę i umieść ją na wcześniej przygotowanej szalce Petriego na lodzie.
4. Używając nożyczek chirurgicznych pod kapturem laminarnym w RT, ostrożnie usuń zarodki z macicy. Usunąć wszystkie pozostałości łożyskowe z zarodków za pomocą kleszczy i umieścić je na nowej 10 cm szalce Petriego wypełnionej buforem Dulbecco.
5. Za pomocą kleszczy lub igieł preparacyjnych odciąć tylną ćwiartkę głowy od miejsc oznaczonych czarnymi strzałkami na rysunku 1A. Odciąć kawałek od reszty zarodka (ryc. 1B).
6. Umieść tylną część wyciętego kawałka w kierunku obserwatora (ryc. 1C) i delikatnie rozetnij go od ogona do czaszki (ryc. 1D). Od 0,5 mm poniżej otworu czaszki wytnij obszar 2 mm²–3^mm2, pokazany na rysunku 1E.
7. Zebrać brzuszne dno śródmózgowia (patrz rysunek 1F) do pustej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Trzymaj probówkę wirówki na lodzie, aż wszystkie podłogi śródmózgowia zostaną w niej zebrane.
   nuta: Alternatywnie, dno śródmózgowia można pobrać za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml po wypreparowaniu wszystkich mózgów zarodków.

3. Zakładanie pierwotnych embrionalnych kultur śródmózgowia z zarodków myszy E13.5 w formacie płytki 96-dołkowej

1. Po zebraniu dna śródmózgowia od wszystkich zarodków w tej samej probówce o pojemności 1,5 ml, usuń resztki buforu Dulbecco i przemyj kawałki tkanki trzykrotnie 500 μl Ca²⁺, Mg²⁺ wolnego od Zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS).
2. Usuń HBSS i dodaj 500 μl 0,5% trypsyny do probówki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
3. Podczas inkubacji ogrzać 1,5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w temperaturze 37 °C, dodać 30 μl DNazy I do FBS i wymieszać. Wypoleruj również ogniowo końcówkę pipety ze szkła silikonowanego. Upewnij się, że otwór nie ma ostrych krawędzi i jest mniej więcej tego samego rozmiaru co końcówka do mikropipet o pojemności 1 ml.
   UWAGA: Alternatywnie do rozcierania można użyć końcówki do mikropipet o niskiej przyczepności o pojemności 1 ml. Jednak pipety ze szkła silikonowanego wydają się dawać najlepsze rezultaty.
4. Jak tylko inkubacja w kroku 3.2 zakończy się, dodać 500 μl mieszaniny FBS/DNazy do częściowo strawionej tkanki. Użyj szklanej pipety, aby rozcierić tkankę w mieszance FBS i trypsyny. Tryturuj, aż tkanki rozpadną się na małe, ledwo widoczne cząstki. Unikaj pęcherzyków podczas rozcierania.
5. Pozwól, aby resztki cząstek wytrąciły się grawitacyjnie na dnie probówki mikrowirówkowej. Nie pipetując osadu na dnie, zebrać supernatant do pustej stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml.
6. Rozcieńczyć FBS/DNazę I z kroku 3.3 (98:2) 1,000 μl HBSS, aby uzyskać FBS/DNazę-I/HBSS (49:1:50). Mieszać, pipetując w górę i w dół. Dodać 1 000 μl nowej mieszanki do pozostałych cząstek w probówce do mikrowirówki. Ponownie rozcierać i powtórzyć krok 3.5.
7. Powtórz poprzedni krok jeszcze raz, aby zużyć wszystkie FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
8. Gdy cały supernatant zostanie zebrany w probówce o pojemności 15 ml (z kroków 3.5, 3.7 i 3.8), użyj wirówki stołowej, aby odwirować supernatant (~3 ml) przy 100 x g, przez 5 minut. Usuń supernatant bez dotykania granulowanych komórek na dole.
9. Umyj osad komórkowy, dodając 2 ml DPM do probówki i odwiruj go przy 100 x g przez 5 minut. Usuń supernatant i powtórz mycie 2x, aby zminimalizować zanieczyszczenia w granulowanych komórkach.
   UWAGA: Zawsze używaj świeżego, podgrzanego DPM dla hodowanych neuronów. Na etapie mycia DPM nie musi być świeży, ale powinien być wstępnie podgrzany do 37 °C.
10. Rozcieńczyć komórki świeżym, ciepłym DPM i przenieść je do probówki mikrowirówkowej. Ilość DPM do rozcieńczenia zależy od liczby zarodków użytych do rozwarstwienia tkanki. Na przykład użyj 150 μl DPM do rozcieńczenia komórek uzyskanych z dziesięciu zarodków.
11. Przenieść 10 μl komórek w DPM do probówki mikrowirówkowej. Wymieszaj je z 10 μl 0,4% niebieskiej plamy trypanowej. Policz żywe (tj. Trypan blue ujemne) komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
    UWAGA: Użyj 30 000 komórek do posiewu na studzienkę, aby uzyskać ~ 1 000 neuronów dopaminowych na studzienkę. Jeśli gęstość komórek jest wyższa niż ~ 30 000 komórek na 6 μl, przed posiewem należy dodatkowo rozcieńczyć komórki DPM, aby objętość wysiewu była nie mniejsza niż 6 μl.
12. Nie dotykając dna studzienek, usuń DPM z mikrowysp utworzonych w kroku 1.6.
13. W celu uzyskania powtarzalnej gęstości komórek w każdym dołku, przed posiewem w studzience należy wymieszać komórki za pomocą delikatnego pipetowania. Za pomocą mikropipety o pojemności 1–10 μl dodaj 6 μl komórek do środka studzienki w miejscu, w którym znajdowała się każda dawna mikrowyspa.
14. Napełnij puste studzienki na krawędziach płytki 150 μl wody lub 1x PBS, aby zminimalizować parowanie z dołków zawierających kultury neuronów. Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 1 godzinę.
15. Po 1 godzinie wyjąć płytkę z inkubatora, dodać 100 μl DPM do każdej studzienki z komórkami i umieścić ją z powrotem w inkubatorze.
16. Dwa dni po posiewie (dzień in vitro 2 lub DIV2) usunąć 25 μl i dodać 75 μl świeżego DPM, aby doprowadzić końcową objętość pożywki do 150 μl i w miarę możliwości uniknąć parowania.
17. Wymień połowę pożywki na świeżą DPM (tj. usuń 75 μl i dodaj 75 μl świeżego DPM) w DIV5. Nie wykonuj żadnych zmian nośników po DIV5.

4. Indukcja agregatów α-synukleiny w pierwotnych embrionalnych neuronach dopaminowych poprzez wysiewanie z wcześniej uformowanymi włókienkami

Po jakiejkolwiek pracy z wstępnie uformowanymi włókienkami (PFF) z α-synukleiny, wyczyść maskę laminarną lub jakikolwiek sprzęt, który mógł mieć kontakt z PFF, za pomocą 1% dodecylosiarczanu sodu (SDS), a następnie 70% etanolu.

1. Przed eksperymentem należy rozcieńczyć PFF 1x PBS do końcowego stężenia 100 μg/ml. Sonikować rozcieńczone PFF w probówkach mikrowirówek za pomocą sonikatora kąpielowego o dużej mocy z chłodzeniem łaźni wodnej w temperaturze 4 °C przez 10 cykli, 30 s ON/30 s OFF.
   nuta: Bardzo ważne jest, aby fibryle były odpowiednio sonikowane, aby wytworzyć fragmenty o długości ~50 nm. Wielkość sonikowanych PFF może być mierzona bezpośrednio z obrazów z transmisyjnego mikroskopu elektronowego barwionych PFF. Sonikację można osiągnąć w sposób opisany powyżej w sonikatorze kąpielowym o dużej mocy. Alternatywnie można użyć sonikatora z końcówką. Sonikowane PFF mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C w małych porcjach, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania/rozmrażania.
2. W przypadku DIV8 dodać 3,75 μl 100 μg/ml PFF na studzienkę do 150 μl pożywki w studzience do końcowego stężenia 2,5 μg/ml. Użyj tej samej ilości 1x PBS dla grupy kontrolnej.
3. Przygotować 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS i przechowywać porcje w temperaturze -20 °C. Aby to zrobić, wykonaj poniższe czynności.
   UWAGA: PFA jest toksyczny; Podczas przygotowań należy nosić maskę i rękawiczki, pracować zawsze pod kapturem laminarnym, a wszystkie stałe i płynne odpady PFA należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucji.
   1. Ciepłe 500 ml 1x PBS w naczyniu o pojemności 1 l. Umieść mieszadło w naczyniu i umieść naczynie na mieszadle magnetycznym z funkcją podgrzewania. Dostosuj temperaturę w zakresie 40–60 °C, aby zapobiec wrzeniu, jednocześnie utrzymując ciepły roztwór.
   2. Odmierz 20 g proszku PFA pod maską w jednorazowym plastikowym pojemniku miarowym. Ostrożnie dodaj proszek PFA do naczynia wypełnionego 1x PBS. Zacznij mieszać roztwór.
   3. Dodać 200 μl 5 M wodorotlenku sodu do roztworu i kontynuować mieszanie przez ~15 minut, aż PFA całkowicie się rozpuści.
   4. Gdy roztwór stanie się jednorodny, dodaj 168 μl 5 M chlorowodoru, aby zrównoważyć pH do ~7. Sprawdź pH za pomocą jednorazowych pasków wskaźnika pH z utrwalonym kolorem.
   5. Wyjąć naczynie z podgrzewacza i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Przefiltrować roztwór i porcję do przechowywania w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozmrozić podwielokrotności w temperaturze pokojowej i nie zamrażać ich ponownie.
4. W przypadku DIV15 usuń wszystkie media z dołków za pomocą pipetowania. Dodać 50 μl 4% PFA do każdej studzienki, aby utrwalić komórki i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji usuń PFA z dołków i dodaj 100 μl 1x PBS do każdej studzienki, aby umyć komórki. Usuń 1x PBS i umyj 2x więcej.
5. Pozostaw 100 μl 1x PBS w każdym dołku, aby uniknąć wysuszenia. Przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C do czasu przeprowadzenia badań immunochemicznych.

5. Barwienie immunofluorescencyjne i automatyczne obrazowanie pierwotnych embrionalnych neuronów dopaminowych na płytkach 96-dołkowych

1. Usuń 1x PBS i przeniknij komórki, dodając 100 μl 0,2% Triton X-100 w PBS (PBST) na dołek i inkubując w RT przez 15 minut.
2. Usunąć PBST i dodać 50 μl 5% normalnej surowicy końskiej (NHS) na studzienkę do PBST. Aby zablokować nieswoistą aktywność antygenu, inkubować w RT przez 1 godzinę.
3. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko hydroksylazie tyrozynowej (TH) i pS129-αsyn (1:2,000) w 5% NHS w PBST. Dodać 50 μl rozcieńczonych przeciwciał do każdego dołka i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
4. Usuń przeciwciała i dodaj 100 μl 1x PBS do każdej studzienki, aby umyć komórki. Usuń 1x PBS i powtórz mycie 2x.
5. Aby zapobiec bieleniu cząsteczek fluorescencyjnych, rozpocznij pracę w minimalnych warunkach oświetleniowych. Rozcieńczyć drugorzędowe przeciwciała znakowane fluorescencyjnie (1:400) w PBST. Dodać 50 μl rozcieńczonych przeciwciał do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
6. Usuń roztwór przeciwciał i dodaj 100 μl 1x PBS do każdej studzienki, aby umyć komórki. Usuń 1x PBS i powtórz mycie 2x.
7. Usunąć 1x PBS, dodać 50 μl 200 ng / ml 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) na studzienkę, aby wybarwić jądra hodowanych komórek i inkubować w temperaturze RT przez 10 minut.
8. Myj komórki 3x 100 μL 1x PBS przez 5 min każda. Trzymaj 100 μl 1x PBS w każdym dołku po ostatnim praniu. Przykryć płytkę folią aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu wykonania obrazu.
9. Zobrazuj pierwotne embrionalne neurony dopaminowe na 96-dołkowej płytce widokowej za pomocą skanera płytek o wysokiej zawartości (patrz tabela materiałów) wyposażonego w obiektyw 10x.
10. Dostosuj ustawienia w oparciu o specyfikacje płytki 96-dołkowej, takie jak typ płytki, producent, rozmiar, odległość między studzienkami, a także rodzaj i ilość medium.
11. Wybierz obszar obrazowania studzienki, aby pokryć wszystkie komórki w mikrowyspie. Wybierz przykład dobrze, aby wyregulować autofokus. Oprzyj początkowy nacisk na DAPI.
12. Skalibruj czas akwizycji dla każdego kanału fluorescencyjnego w oparciu o intensywność barwienia w studzienkach kontrolnych. Dostosuj parametry tak, aby w studzienkach kontrolnych traktowanych PFF można było wyraźnie rozróżnić komórki dopaminowe zawierające agregaty pS129-αsyn w somie komórki, co pozwala na jednoznaczne określenie ilościowe komórek pS129-αsyn dodatni i pS129-αsyn ujemny.
    nuta: Studzienki, które nie zawierają PFF, nie powinny mieć żadnych zabarwień dla pS129-αsyn; dlatego studnie te mogą być używane jako kontrola ujemna do regulacji intensywności pS129-αsyn.
13. Zobrazuj wszystkie wybrane studzienki obiektywem 10x jednocześnie dla wszystkich kanałów z barwieniem immunofluorescencyjnym o dokładnie tych samych parametrach.
14. Opcjonalnie znakować inkluzje α-synukleiny w podzbiorze studzienek z przeciwciałami specyficznymi dla nitkowatej α-synukleiny, aby potwierdzić, że zmiany w liczbie inkluzji pS129-αsyn-dodatnich odzwierciedlają zmniejszenie akumulacji białka, a nie hamowanie fosforylacji lub defosforylacji pS129-αsyn.
15. Powtórz krok 5.3, zastępując przeciwciało pS129-αsyn przeciwciałem z włókien α-synukleiny (1:2 000). Wyobraź sobie barwioną zagregowaną α-synukleinę, jak w kroku 5.13.

Results

Rycina 1: Rozwarstwienie dna śródmózgowia z zarodka myszy E13.5. (A) Miejsca cięcia w tylnej ćwiartce głowy są oznaczone czarnymi strzałkami i białymi liniami przerywanymi. (B) Fragment został usunięty z reszty zarodka. Usunięty fragment jest zakreślony. (C) Pionek został obrócony o 90° tak, aby był skierowany do tyłu w kierunku obserwatora. (

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,4% Plama błękitu trypanowego	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	15250061
Tuba polipropylenowa 15 ml CELLSTAR	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy	188261
4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	10236276001
5 mln HCl	N/a	N/a	Kuchnia medialna, Instytut Biotechnologii, Uniwersytet w Helsinkach
5 mln NaOH	N/a	N/a	Kuchnia medialna, Instytut Biotechnologii, Uniwersytet w Helsinkach
96-dołkowa płytka widokowa ()	PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	6005182
99,5% etanol (EtOH)	Altia Oyj, Rajamäki, Finlandia	N/a
AquaSil Płyn silikonowy	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	TS-42799
Autoklawizowana probówka mikrowirówkowa o pojemności 1,5 ml	N/a	N/a	Kuchnia medialna, Instytut Biotechnologii, Uniwersytet w Helsinkach
Urządzenie do sonikacji Bioruptor	Diagenode, Liège, Belgia	B01020001
Zrównoważony roztwór soli Hanka wolny od Ca2+, Mg2+ (HBSS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 14175-053
Pakiety oprogramowania CellProfiler i CellAnalyst	N/a	N/a	Darmowe oprogramowanie typu open source
Wirówka 5702	Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy	5702000019
Inkubator CO2	HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	N/a
Komora liczenia	BioRad Inc., Hercules, Kalifornia, Stany Zjednoczone	1450015
Mikroskop DeltaVision o ultrawysokiej rozdzielczości ze stołem pneumatycznym i szafką	GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, Stany Zjednoczone	29254706
Deoksyrybonukleaza-I (Dnaza I)	Roche, Bazylea, Szwajcaria	22098700
D-glukoza	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	G8769
DMEM/F12	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	21331–020
osioł anty-mysz AlexaFluor 488	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	A21202
osioł anty-królik AlexaFluor 647	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	A31573 (wersja
osioł anty-owca AlexaFluor 488	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	A11015
Bufor Dulbecco	N/a	N/a	Kuchnia medialna, Instytut Biotechnologii, Uniwersytet w Helsinkach
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	10500056
Fisherbrand Plain Economy PTFE Mieszadło	fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	11507582
Zautomatyzowany system obrazowania ImageXpress Nano	Molecular Devices, San Jose, Kalifornia, USA	N/a
L-glutamina	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	25030–032
Mysia monoklonalna hydroksylaza antytyrozynowa	Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Niemiecki	MAB318 powiedział
Suplement N2	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	17502–048
Normalna surowica konia	Vector Laboratories Inc., Burlingame, Kalifornia, Stany Zjednoczone	S-2000
paraformaldehyd (PFA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	158127
paraformaldehyd w proszku, 95%	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	158127
pH-Fix, paski wskaźnikowe z utrwalonym kolorem	Macherey-Nagel, Düren, Niemcy	Numer katalogowy: 92110
Bufor fospohatowy z solą fizjologiczną (PBS)	N/a	N/a	Kuchnia medialna, Instytut Biotechnologii, Uniwersytet w Helsinkach
poli-L-ornityna	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał P4957
Primocin	InvivoGen, San Diego, Kalifornia, Stany Zjednoczone	ANT-PM-1, ANT-PM-2
króliczy monoklonalny filament anty-alfa-synukleinowy	Abcam, Cambridge, Wielka Brytania	ab209538
królicza monoklonalna antyfosfa-seryna129-alfa-synukleina	Abcam, Cambridge, Wielka Brytania	ab51253
RCT Basic, Mieszadło magnetyczne IKA	IKA-Werke® GmbH, Staufen, Niemcy	Numer katalogowy: 3810000
rekombinowany ludzki czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego (hGDNF)	PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA lub Prospec, Ness-Ziona, Izrael	450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec)
rekombinowane mysie alfa synukleiny wstępnie uformowane fibryle (PFF)	N/a	N/a	Prezent od współpracownika, prof. Kelvina C. Luka
Badawczy system stereoskopowy	Olympus Corporation, Tokio, Japonia	SZX10
Poliklonalna hydroksylaza antytyrozynowa owiec	Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Niemiecki	ab1542
Automatyczny licznik komórek TC 20	BioRad Inc., Hercules, Kalifornia, Stany Zjednoczone	1450102
Tryton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone	11332481001
trypsyna	MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, Chiny	Numer katalogowy: 2199700