$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie roztworów hemoglobiny i płynu mózgowo-rdzeniowego
- Przygotować sterylny roztwór sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF), dodając 500 μl roztworu aCSF do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać na lodzie.
- Przygotować sterylny roztwór hemoglobiny o stężeniu 150 mg/ml, dodając 75 mg hemoglobiny do 500 μl aCSF w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml i przechowywać na lodzie.
2. Przygotowanie zwierzęcia do iniekcji
- Ustaw poduszkę grzewczą na średnie ustawienie, aby utrzymać temperaturę ciała szczura.
- Znieczulenie szczurów po urodzeniu w 4. dobie (P4) należy umieścić w komorze indukcyjnej wypełnionej 3% izofluranem.
UWAGA: Potwierdź wystarczające znieczulenie, używając reakcji na uszczypnięcie palca/ogona co 15 minut. Monitoruj znieczulenie z wizualną obserwacją koloru tkanek, temperatury ciała i częstości oddechów.
- Znieczulonemu szczurowi należy podać środek przeciwbólowy za pomocą podskórnego wstrzyknięcia karprofenu w dawce 5 mg/kg.
- Umieścić znieczulonego szczura leżącego w aparacie stereotaktycznym z nosem umieszczonym w adapterze anestezjologicznym ze stałym przepływem 1,5% izofluranu.
- Dokręć niepękające pręty uszne na zewnętrznym przewodzie słuchowym, aby zabezpieczyć głowę.
UWAGA: Zastosuj maść weterynaryjną, aby utrzymać nawilżenie oczu, jeśli oczy są otwarte w wieku wstrzyknięcia.
- Wyczyść głowę, na przemian sterylnymi aplikatorami z bawełnianą końcówką nasączonymi betadyną i 70% etanolem.
- Przyłóż aplikator nasączony betadyną do środka skóry głowy i rozprowadź betadynę okrężnymi ruchami, przesuwając się na zewnątrz.
- Powtórzyć krok 2.6.1.1 z aplikatorem nasączonym etanolem.
- Powtórz krok 2.6.1.1 i krok 2.6.1.2 3x.
- Zastosuj sterylną serwetę chirurgiczną, aby chronić pole operacyjne.
- Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj nacięcie o długości 0,3 cm pionowo w dół środka głowy, aby odsłonić bregmę czaszki.
UWAGA: W przypadku wstrzykiwania z lambdy, należy odsłonić lambdę czaszki zamiast bregmy.
- Użyj sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką, aby wysuszyć obszar.
3. Konfiguracja wtryskiwacza stereotaktycznego
- Pobrać roztwór hemoglobiny przygotowany w kroku 1.2 do sterylnej strzykawki o pojemności 0,3 ml z igłą 30G i umieścić strzykawkę w stereotaktycznym systemie wstrzykiwań.
UWAGA: Jeśli generujesz warunki kontrolne, pobierz roztwór płynu mózgowo-rdzeniowego przygotowany w kroku 1.1 do sterylnej strzykawki o pojemności 0,3 ml i postępuj zgodnie z protokołem.
- Włącz interfejs wtryskiwacza stereotaktycznego i kliknij przycisk Configuration , aby wprowadzić ustawienia objętości i szybkości wtrysku.
- Kliknij na Volume i ustaw wolumin na 20,000 nL (20 μL).
- Kliknij Szybkość infuzji i ustaw szybkość na 8,000 nL/min (8 μL/min).
- Wyjdź z Konfiguracja , klikając przycisk Resetuj pozycję .
- Przepłucz końcówkę igły, klikając przycisk Infuse , aż na końcu igły pojawi się mała kulka roztworu hemoglobiny.
- Delikatnie odsączyć roztwór hemoglobiny z końcówki igły za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką.
4. Wstrzyknięcie dla zwierząt
- Ustaw bregma jako zero w stereotaktycznym systemie wstrzykiwaczy, dostosowując przyśrodkowe i przednio-tylne położenie strzykawki przed opuszczeniem końcówki przepłukanej igły strzykawki, aby delikatnie dotknąć czaszki w bregmie.
UWAGA: Jeśli wtryskujesz z lambdy, ustaw lambda jako zero.
- Zidentyfikuj współrzędne wyboru.
- W przypadku wstrzykiwania z bregmy, u P4 szczurów opisanych tutaj, użyj 1,5 mm bocznie, 0,4 mm z przodu i 2,0 mm głębokości od bregmy.
- W przypadku wstrzykiwania z lambdy użyj następujących współrzędnych dla szczurów P4: 1,1 mm boczny, 4,6 mm przedni i 3,3 mm głębokości od lambdy.
- Podnieś igłę strzykawki 1 cm nad czaszkę, aby oczyścić skórę głowy. Gdy strzykawka zostanie podniesiona, przystąp do ustawiania współrzędnych przyśrodkowo-bocznych i przednio-tylnych.
- Opuścić igłę strzykawki, aby delikatnie dotknąć czaszki. Sprawdź, czy igła dotyka czaszki.
- Ustaw współrzędną grzbietowo-brzuszną w okresie 30 sekund.
UWAGA: Podczas ustawiania współrzędnej grzbietowo-brzusznej, igła przebije czaszkę. Należy dołożyć starań, aby strzykawka przeszła przez czaszkę bez deformacji czaszki. Deformacji czaszki unika się, powoli wycofując igłę wzdłuż współrzędnej grzbietowo-brzusznej, jeśli wystąpi deformacja, a następnie umieszczając igłę z powrotem wzdłuż tej samej trajektorii. Dzięki temu igła przechodzi przez otwór w czaszce z mniejszą siłą i bez deformacji.
- W interfejsie wtryskiwacza stereotaktycznego kliknij przycisk Uruchom , aby rozpocząć wstrzykiwanie.
- Po zakończeniu wstrzykiwania należy pozostawić igłę strzykawki na miejscu na 2 minuty, aby zminimalizować cofanie się roztworu.
- Powoli wyjmować strzykawkę wzdłuż współrzędnej grzbietowo-brzusznej przez 2 minuty, aż końcówka igły znajdzie się 2 cm nad skórą głowy.
- Obróć ramię wtryskiwacza stereotaktycznego z dala od pola operacyjnego.
5. Opieka pooperacyjna
- Zamknij skórę głowy szwem monofilamentowym 6-0. Wykonaj jeden prosty przerywany szew w środku nacięcia o długości 0,3 cm.
- Wyjmij szczeniaka ze znieczulenia i umieść go w bezpiecznym miejscu na poduszce grzewczej.
- Wróć gryzonia do klatki domowej, aby doszedł do siebie po znieczuleniu pod opieką jego matki.
UWAGA: Szybki powrót pod opiekę matki zmniejsza wczesną śmiertelność pooperacyjną.
- Monitoruj zwierzęta pod kątem znieczulenia przez utratę odruchu prostującego co godzinę po operacji przez 3 godziny.
- Monitoruj zwierzęta codziennie przez 7 dni pod kątem normalnej aktywności, spożycia pokarmu i przyrostu masy ciała. Monitoruj miejsce nacięcia pod kątem gojenia się ran, zamykania i ponownego pojawienia się futra w miejscu operacji.
UWAGA: W rzadkich przypadkach, gdy podczas monitorowania obserwuje się zmiany neurologiczne, takie jak drgawki, depresja centralna lub zmniejszony apetyt, należy poddać zwierzę eutanazji za pomocą perfuzji wewnątrznaczyniowej lub zwichnięcia szyjki macicy w znieczuleniu.
- Aby zapobiec infekcji po zamknięciu szwu i gojeniu się rany, należy zastosować miejscowy potrójny antybiotyk w miejscu nacięcia.