Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie do testu napadowego wywołanego wysoką temperaturą
- Włącz przycisk Power On na komorze grzewczej, a następnie przycisk Heat On.
- Ustaw temperaturę komory grzewczej na 50 °C za pomocą klawiatury na cyfrowym regulatorze temperatury.
- Odczekaj co najmniej 1 godzinę, aby podgrzać komorę do 50 °C przed wprowadzeniem pierwszej myszy do komory. Podgrzewanie zapewnia równomierne nagrzewanie wewnątrz komory.
- Wyłóż podłogę komory grzewczej myszy ściółką z kolb.
- Zamontuj kamerę rejestrującą wideo przed komorą cieplną, aby rejestrować każdą próbę testu napadowego wywołanego ciepłem.
- Wyłóż szalkę Petriego o średnicy 140 mm grubymi warstwami bibuły i umieść ją na lodzie, aby służyła jako podkładka chłodząca.
nuta: Pod koniec testu poszczególne myszy zostaną przeniesione do wstępnie schłodzonej podkładki chłodzącej, aby obniżyć ich podwyższoną temperaturę ciała.
2. Przygotowanie myszy do testu na napady wywołane wysoką temperaturą
- Wybierz 10 dorosłych myszy (P30-P40), 5 będących nosicielami mutacji powodującej padaczkę i 5 dzikich rodzeństwa z miotu do testu przesiewowego w kierunku napadów wywołanych upałem.
nuta: Myszy typu dzikiego, nie posiadające żadnej mutacji powodującej padaczkę, nie wykazują napadów wywołanych ciepłem w temperaturach poniżej 44 °C i służą jako grupa kontrolna.
- Zważyć każdą mysz, która ma być wykorzystana do testu przesiewowego, i zapisać jej masę ciała. Do testu należy używać wyłącznie myszy o masie ciała 15 g lub większej.
- Wyświetlaj jedną mysz na raz w komorze grzewczej myszy.
- Krótko znieczulaj mysz przez 10-15 sekund, używając kilku kropli izofluranu na dnie słoika.
- Wyjmij zwierzę ze słoika i połóż je na ręczniku papierowym.
- Upewnij się, że mysz jest całkowicie znieczulona, sprawdzając, czy mysz nie reaguje na szkodliwe szczypanie palca.
- Pokryj metalową końcówkę sondy temperatury doodbytniczej smarem (takim jak wazelina) i delikatnie włóż go do myszy na głębokość mniejszą lub równą 2 cm.
- Przymocuj sondę doodbytniczą do ogona myszy za pomocą taśmy, aby sonda nie wysunęła się podczas testu.
nuta: Alternatywnie umieść zwierzę w stożku przytrzymującym myszy i włóż sondę temperatury doodbytniczą. Zabezpiecz go, przyklejając go taśmą do ogona.
- Upewnij się, że sonda doodbytnicza jest podłączona do multimetru, który wyświetla wewnętrzną temperaturę ciała myszy.
- Umieść zwierzę w nowej klatce wyłożonej ściółką z kolb, tj. klatce rekonwalescencyjnej.
- Uruchom minutnik i odczekaj 5 minut. Obserwuj mysz, aż całkowicie wyzdrowieje ze znieczulenia, a mysz będzie aktywna i pielęgnowana.
- Jednocześnie monitoruj temperaturę ciała myszy, aż ustabilizuje się na poziomie 35-36 °C.
- Pod koniec 5 minut zanotuj temperaturę ciała myszy. Jest to początkowa temperatura ciała w czasie "0" min.
nuta: Jeśli temperatura ciała myszy jest niższa niż 35 °C, poczekaj na dodatkowy czas, aż zwierzę dojdzie do siebie po hipotermii wywołanej znieczuleniem.
- Szybko przenieś pojedynczą mysz do wstępnie nagrzanej komory myszy. To oznacza POCZĄTEK próby eksperymentalnej. W danym momencie wyświetlana jest tylko jedna mysz.
3. Test napadów padaczkowych wywołanych wysoką temperaturą
- Po delikatnym umieszczeniu myszy na podłodze wstępnie podgrzanej komory grzewczej myszy, zamknij drzwiczki z pleksi i uruchom kamerę, aby nagrać eksperyment na wideo.
- Uruchom stoper. Rejestruj temperaturę ciała myszy z termometru doodbytniczego w odstępach 1-minutowych przez cały czas trwania eksperymentu.
- W regularnych odstępach czasu zwiększaj temperaturę komory grzewczej myszy tak, aby temperatura ciała myszy rosła w tempie 0,25-0,5 °C /min.
nuta: Gwałtowny wzrost temperatury ciała może prowadzić do udaru cieplnego lub śmierci i należy tego unikać.
- Postępując zgodnie z tym protokołem, zwiększaj temperaturę komory grzewczej myszy o 5 °C co 10 minut, jak pokazano na rysunku 1A.
- Po 9.5 min ustaw temperaturę komory grzewczej na 55 °C, aby ustabilizować temperaturę komory grzewczej do 55 °C do 10 minuty, jak pokazano na cyfrowym wyświetlaczu temperatury.
- Podobnie zwiększ temperaturę do 60 °C po 19,5 min, aby ustabilizować temperaturę komory grzewczej do 60 °C do 20 min. Każda próba przesiewowa w kierunku napadów trwa 30 minut.
- Jeśli mysz ma napad padaczkowy (wokalizuje, pokazuje kiwanie głową, klonus kończyn przednich, wyprost kończyn tylnych, upada na bok lub doświadcza uogólnionych drgawek tonicznych/klonicznych), zapisz następujące informacje.
- Zapisz temperaturę ciała myszy podczas napadu (temperatura progu drgawkowego) z termometru do pomiaru temperatury w odbycie.
- Rejestruj cechy zachowania napadowego, takie jak kiwanie głową, klonus kończyn przednich, wyprost kończyn tylnych, upadek na bok i/lub uogólnione napady toniczne/kloniczne (GTCS) wyświetlane przez mysz.
- Szybko, ale delikatnie wyjmij mysz z komory i umieść ją na podkładce chłodzącej przygotowanej w kroku 1.6.
nuta: Jeśli mysz doświadcza napadów w skali Racine'a 5 i wykazuje niekontrolowane skakanie, może być trudno podnieść zwierzę z komory grzewczej i przenieść je na zewnątrz do podkładki chłodzącej. Jednak typowy napad wywołany ciepłem trwa od 30 s do 60 s. Dlatego mysz powinna zostać wyjęta z komory grzewczej i umieszczona na podkładce chłodzącej w ciągu 60 s od rozpoczęcia epizodu napadu wywołanego ciepłem.
- Poczekaj, aż temperatura ciała myszy spadnie do 36-37 °C, zanim przeniesiesz ją do klatki odzyskiwania. Tylko jedna mysz jest umieszczana w klatce odzyskiwania na raz.
nuta: Nie mieszaj myszy, które nie zostały jeszcze użyte do badań przesiewowych wywołanych ciepłem, z myszą, która już doświadczyła próby eksperymentalnej z napadami wywołanymi ciepłem.
- Delikatnie i ostrożnie przetnij taśmę między ogonem myszy a drutem sondy doodbytniczej nożyczkami, aby usunąć sondę doodbytniczą z myszy.
- Wytrzyj metalową końcówkę sondy doodbytniczej 70% alkoholem i chusteczkami do tkanek miękkich, aby była gotowa do następnej próby.
- Kontynuuj obserwację myszy w klatce odzyskiwania, dopóki nie wznowi normalnej aktywności (chodzenie, pielęgnacja itp.), zanim wróci do klatki domowej. To oznacza KONIEC próby eksperymentalnej dla tej myszy.
- Rejestruje się status zwierzęcia po wykonaniu testu – żywego i odzyskanego z sesji badawczej lub martwego. Napady o dużej intensywności polegające na niekontrolowanym skakaniu i uogólnionych napadach tonicznych/klonicznych mogą czasami prowadzić do śmierci myszy.
- Jeśli mysz nie doświadczy napadów wywołanych ciepłem w ciągu 30-minutowego okresu obserwacji lub temperatura ciała myszy osiągnie 44 °C, wyjmij mysz z komory grzewczej i umieść ją na podkładce chłodzącej, aż temperatura ciała myszy powróci do 36-37 °C.
- Zresetuj temperaturę komory grzewczej myszy do 50 °C i pozwól jej się zrównoważyć, aż temperatura na wyświetlaczu cyfrowego regulatora temperatury pokaże 50 °C.
- Zmieniaj ściółkę kolb między poszczególnymi próbami na myszach.
