Ustalenie modelu napadów padaczkowych indukowanych pentylenotetrazolem u myszy

Streszczenie

Źródło: Shimada, T., et al. Model rozpałki indukowany pentylenetetrazolem. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film pokazuje proces wywoływania padaczki u myszy za pomocą zastrzyków z pentylenotetrazolu (PTZ), antagonisty receptora GABA-A. Wielokrotne dootrzewnowe podawanie PTZ stopniowo obniża próg drgawkowy poprzez hamowanie napływu jonów chlorkowych, zakłócanie hamowania neurotransmisji i prowadzenie do nadpobudliwości neuronów, które wywołują drgawki. Proces ten prowadzi do rozpalenia i rozwoju napadów samoistnych, naśladujących przewlekłą padaczkę.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie Pentylenotetrazol (PTZ)

1. Rozpuścić 2 mg/ml PTZ w sterylnym 0,9% (w/v) NaCl. Przygotuj PTZ w dniu użytkowania.

2. Wstrzyknięcie PTZ

1. Wszystkie eksperymenty wykonuj między 9:00 a 12:00 (w południe).
2. Zmierz masę ciała zwierzęcia.
3. Umieść zwierzę w komorze obserwacyjnej w celu przyzwyczajenia.
4. W okresie przyzwyczajenia (3 min) należy obliczyć objętość roztworu PTZ do wstrzykiwań na podstawie masy ciała zwierzęcia i wcześniej ustalonej dawki do wstrzyknięcia.
   UWAGA: Na przykład, gdy używany jest PTZ 35 mg/kg, 0,875 mg PTZ jest wymagane dla myszy ważącej 25 g (35 mg/kg x 0,025 kg = 0,875 mg). Dlatego należy wstrzyknąć 437,5 μl roztworu PTZ o stężeniu 2 mg/ml (0,875 mg / 2 mg/ml = 0,4375 ml). Dawka do wstrzykiwań PTZ zależy od genotypu i szczepu myszy. W przypadku myszy C57BL/6 typu dzikiego w pierwszym badaniu zalecana jest dawka 30-35 mg PTZ/kg masy ciała. Czułość na PTZ zależy od używanego szczepu myszy. Dawka do wstrzykiwań różni się w zależności od celu eksperymentu.
5. Wstrzyknąć PTZ dootrzewnowo za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml przymocowanej do igły o rozmiarze 27 w lewą lub prawą ćwiartkę brzucha zwierzęcia. Należy unikać wstrzykiwania w linii środkowej.
   1. Należy unikać wielokrotnych wstrzyknięć w tę samą pozycję.
6. Obserwuj zachowania zwierząt przez 30 minut po podaniu PTZ (Rysunek 1A) i klasyfikuj i oceniaj nieprawidłowe zachowanie, jak pokazano poniżej. Jeśli to możliwe, należy utrzymywać zwierzęta pod obserwacją przez 24 godziny lub co najmniej dodatkowe 6-10 godzin po wstrzyknięciu, zwłaszcza gdy nasilenie napadu osiągnie 3 lub więcej.
   1. Zwróć uwagę na wszelkie łagodne napady lub zmiany w zachowaniu zwierząt po upływie 30-minutowego okresu obserwacji. Ten przedłużony okres obserwacji może dotyczyć szczególnie ważnego i pełnego wpływu poddrgawkowej dawki PTZ na powstawanie przewlekłych, niesprowokowanych napadów padaczkowych w padaczce.
   2. Ponadto należy zmierzyć czas trwania napadu dla każdego zaobserwowanego napadu, ponieważ zmiany czasu trwania napadu odnoszą się do nasilenia napadu. Co więcej, opóźnienie do pierwszego napadu po wstrzyknięciu PTZ jest kolejnym ważnym pomiarem do zebrania. Monitorowanie częstotliwości, czasu trwania i opóźnienia napadów ma kluczowe znaczenie dla wszelkich badań molekularnych po napadzie.
7. Wstrzykiwaj PTZ co drugi dzień (Rysunek 1A). Liczba wstrzyknięć zależy od celu eksperymentu. Reprezentatywne przykłady są następujące.
   1. Aby wygenerować całkowicie rozpalone zwierzęta, gdy zwierzę doświadczy napadu z wynikiem 5 (napad toniczno-kloniczny), zakończ wstrzyknięcie w ciągu dodatkowych trzech podań. W takim przypadku należy zwiększyć dawkę do wstrzykiwań, jeśli napad nie zwiększa się przez trzy kolejne podania. Każde zwierzę może otrzymać inną liczbę i dawkę zastrzyków PTZ.
   2. Ustal liczbę i dawkę wstrzyknięcia PTZ w każdym stanie, aby ocenić podatność na PTZ, w tym w ocenie leków przeciwpadaczkowych i badaniach fenotypu myszy zmodyfikowanych genetycznie. Wszystkim zwierzętom należy podać taką samą liczbę wstrzyknięć PTZ; Zaleca się wykonanie od 8 do 12 wstrzyknięć. Jeśli zwierzę padnie, wynik napadu powinien być oznaczony jako 6.
   3. Należy określić dawkę iniekcji niezbędną do utrzymania wysokiej liczby napadów (4 lub 5) dla 10 lub więcej wstrzyknięć w celu zbadania zmian histopatologicznych występujących w napadach padaczkowych. W takim przypadku całkowita liczba wstrzyknięć powinna wynosić od 25 do 30. Należy zmniejszyć dawkę do wstrzyknięcia, jeśli liczba napadów osiągnie 5. Jeśli częstość napadów zmniejszy się do 3 lub mniej, należy zwiększyć dawkę do wstrzykiwań.

Wyniki

Rysunek 1: Krótki opis protokołu. (A) Schematyczna ilustracja rozpałki za pośrednictwem PTZ. (B) Ilustracje reprezentatywnych zachowań zwierząt dla odpowiednich wyników napadów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pentylenotetrazol	Sigma-Aldrich	P6500
Chlorek sodu	MANAC	7647-14-5
Mysz	CLEA Japonia		C57Bl/6NJcl, po porodzie 8 tygodni, mężczyzna
Strzykawka (1mL)	Terumo	SS-01T
Igła (27G x 3/4") (0,40 x 19 mm)	Terumo	NN-2719S
Waga	Mettler	PE2000	Ten produkt jest produktem wycofanym z rynku. Prawie odpowiednik FX-2000i z FXi-12-JA firmy A&D.