Wywoływanie niedokrwienia poprzez niedrożność środkowej części mózgu i tętnicy szyjnej wspólnej w modelu szczurzym

Streszczenie

Źródło: Wayman, C. et al., Wykonywanie stałej dystalnej środkowej części mózgu ze wspólnym niedrożnością tętnicy szyjnej u starszych szczurów w celu zbadania niedokrwienia kory mózgowej z trwałą niepełnosprawnością. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film przedstawia procedurę wykonywania trwałej dystalnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu lub MCAO z tętnicą szyjną wspólną lub podwiązaniem CCA u starszych szczurów w celu modelowania udaru niedokrwiennego. Blokuje to przepływ krwi do mózgu, prowadząc do śmierci neuronów i generowania modelu do badania mechanizmów udaru i potencjalnych metod leczenia.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Chirurgia

1. Stosować samice szczurów w podeszłym wieku w wieku 16-18 miesięcy (250 do 400 g) i indukować znieczulenie 5% izofluranem w 1,5 l/min O₂. Po indukcji znieczulenia należy zmniejszyć poziom izofluranu i utrzymywać go na odpowiedniej, ale zminimalizowanej głębokości do zabiegu (e.g., 1,5-2%). Podać zwierzęciu znieczulenie za pomocą maski na twarz i użyć systemu oczyszczającego, aby ograniczyć narażenie chirurga na izofluran.
   1. Wykonuj wszystkie procedury, w tym kraniotomię na zwierzętach pozorowanych, ponieważ ta procedura może powodować deficyty behawioralne. Rozważ cele eksperymentalne podczas projektowania eksperymentów z okluzją tętnicy środkowej mózgu (MCAO) i zdecyduj, czy należy uwzględnić grupę pozorowaną do kontroli kraniotomii.
2. Środek przeciwbólowy należy podawać przed lub w trakcie operacji (Carprieve, 0,25 mg/kg, s. cięcie).
   1. Dodać 1 ml do 19 ml sterylnego 0,9% roztworu soli fizjologicznej w celu przygotowania roztworu podstawowego i wstrzyknąć 0,6 ml na 300 g szczura. Stosowanie Carprieve jest preferowane w stosunku do Carprofenu, ponieważ ten pierwszy jest stabilny w temperaturze pokojowej (RT).
3. Ogol futro w brzusznej okolicy szyi i okolicy skroniowej w prawej półkuli, aby odsłonić skórę. Zdezynfekuj miejsca operacyjne za pomocą wacików na etanolu.
   1. Wykonaj ten krok z dala od obszaru operacyjnego, aby zminimalizować ilość sierści w miejscu nacięcia.
4. Umieść szczura na tablicy korkowej pokrytej sterylną serwetą w pozycji leżącej na poduszce grzewczej. Nałóż krem z lidokainą na ogolone obszary głowy i szyi. Wprowadzić sondę doodbytniczą, aby monitorować i utrzymywać temperaturę zwierzęcia w zakresie 36,5-37,5 °C za pomocą systemu homeotermicznego.
   1. Nałóż maść lacrilube na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Podać szczurowi zastrzyk roztworu siarczanu atropiny (0,05 ml roztworu o stężeniu 600 μg/ml podskórnie) w celu zmniejszenia wydzieliny tchawicy.
      UWAGA: Naukowcy powinni rozważyć pomiar zmiennych fizjologicznych, takich jak gazometria krwi i ciśnienie.
5. Przed rozpoczęciem operacji sprawdź wycofanie szczypania tylnej łapy i odruchy mrugania, aby potwierdzić pełne znieczulenie.
6. Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj 2-centymetrowe środkowe nacięcie linii środkowej na odsłoniętej szyi za pomocą skalpela. Delikatnie przesuń ślinianki na boki do tchawicy po obu stronach.
7. Owiń niewchłanialny jedwabny szew wokół skóry, który z jednej strony pokrywa wspólną tętnicę szyjną. Delikatnie odciągnij skórę od miejsca za pomocą jedwabnego szwu i przyklej je do tablicy korkowej za pomocą taśmy chirurgicznej, aby odsłonić tętnicę szyjną wspólną. Ostrożnie tępo wypreparuj tętnice wolne od otaczającej powięzi i nerwów błędnych za pomocą cienkich kleszczy.
   1. Uważaj, aby nie uszkodzić mięśni lub nerwów błędnych podczas tego etapu, ponieważ upośledza to karmienie, połykanie i oddychanie.
8. Po odsłonięciu tętnicy szyjnej wspólnej użyj niewchłanialnego jedwabnego szwu (5/0), aby wyizolować tętnicę szyjną, najpierw oddzielając tętnicę szyjną od nerwu błędnego poprzez odwrotne rozwarstwienie cienkimi kleszczami i uważając, aby nie nawiązać kontaktu z nerwem. Gdy naczynie zostanie zapętlone (ale nie związane) szwem, sklej końce szwu taśmą chirurgiczną, aby zapobiec cofnięciu tego kroku. Usuń szwy przytrzymujące leżącą na powierzchni skórę.
9. Powtórz dla drugiej strony.
10. Umieść sterylną gazę nasączoną solą fizjologiczną w ranie, aby utrzymać wilgotność tkanek przez pozostałą część operacji. Luźno zszyj skórę i umieść na tym obszarze dodatkową gazę nasączoną solą fizjologiczną, aby zapobiec dalszemu odwodnieniu.
11. Umieść szczury w pozycji bocznej i wykonaj nacięcie w skórze w połowie między prawym oczodołem a zewnętrznym kanałem słuchowym. Cofnij skórę za pomocą maksymalnie pięciu elastycznych zwijaczy hakowych 3 mm przypiętych do tablicy korkowej, a następnie tępo rozetnij mięsień skroniowy, aby odsłonić czaszkę.
12. Umieść dostosowaną do pokrętła grawitacyjną kroplówkę z solą fizjologiczną nad otwartym miejscem (szybkość przepływu około 2 ml / min) i ustaw system aspiratorów w celu usunięcia resztek kostnych i usunięcia niewielkiego krwawienia z odsłoniętego miejsca przez całą tę fazę operacji.
    1. Umieść dyszę doprowadzającą sól fizjologiczną w najwyższym punkcie czaszki w pobliżu ucha, a dyszę aspiratora w najniższym punkcie. Dostosuj koło podczas krwawień, aby dostarczyć więcej soli fizjologicznej do obszaru, aby lepiej uwidocznić źródło krwawienia w celu kauteryzacji naczynia, skracając czas, w którym zwierzęta są pod narkozą.
13. Wykonaj kraniotomię na odsłoniętym obszarze (około 5 mm x 5 mm) za pomocą wiertła dentystycznego z grubym zadziorem wiertarskim o średnicy 1,6 mm z powłoką diamentową przy około 8,000 obr./min, zapewniając zastosowanie ciśnienia okrężnego i bocznego, a nie nacisku w dół podczas wiercenia odsłoniętego obszaru. Gdy kość jest na tyle cienka, że wygląda na całkowicie przezroczystą, usuń ją za pomocą kleszczy.
14. Użyj domowego haczyka duralowego, wykonanego przez zgięcie jednej końcówki cienkich kleszczyków pod kątem około 180 °, aby utworzyć łuk, aby ostrożnie otworzyć oponę twardą, uważając, aby uniknąć naczyń krwionośnych o dużej powierzchni, ponieważ są one delikatne i łatwe do pęknięcia.
    UWAGA: Odsłonięty obszar mózgu ujawni tętnicę środkową mózgu (MCA); żądany segment ma około 2 mm długości (patrz Rysunek 1).
15. Koagulować MCA od miejsca, w którym przecina się dolna żyła mózgowa, do punktu rozwidlenia tętnicy, a następnie wzdłuż gałęzi ogonowych MCA za pomocą pary kleszczy do diatermii, aż do całkowitego zamknięcia. Użyj kątowych kleszczyków do diatermii Jeweler ze spiczastymi końcówkami 0,25 mm.
    1. Podczas zamykania tętnicy należy w razie potrzeby zmienić przepływ soli fizjologicznej, aby utrzymać ten obszar w chłodzie, zapobiegając przyleganiu kleszczy krzepnących do naczynia krwionośnego. Po zamknięciu naczynie krwionośne wydaje się czarne i nie powinno być żadnych oznak przepływu krwi; Przepływ krwi można zaobserwować w częściowo zamkniętych naczyniach.
    2. W tym momencie odetnij MCA, aby potwierdzić całkowitą okluzję. Za pomocą nożyczek mikronaczyniowych przeciąć poniżej miejsca, w którym dolna żyła mózgowa przecina MCA.
    3. Przykryj odsłonięty obszar gazikiem nasączonym solą fizjologiczną, zanim przejdziesz do następnego kroku.
16. Obróć szczura z powrotem do pozycji leżącej na plecach i ponownie otwórz luźno zawiązany szew na szyi, aby ponownie odsłonić tętnice szyjne. Podwiązać tętnicę szyjną po tej samej stronie, co niedrożny MCA (po prawej), zawiązując węzeł w jedwabnym szwie wokół tętnicy szyjnej, podczas gdy lewa tętnica szyjna jest przejściowo niedrożna za pomocą 13-milimetrowego klipsa tętniczego ze stali nierdzewnej o nacisku 125 g przez 60 minut. W tym czasie luźno zszyj nacięcie na szyi i umieść na wierzchu sterylną gazę nasączoną solą fizjologiczną, aby zapobiec odwodnieniu.
    1. Należy pamiętać, że prawa strona zwierzęcia będzie znajdować się po lewej stronie chirurga, biorąc pod uwagę pozycję leżącą.

Wyniki

Rysunek 1. Operacyjne ustawienie stałego modelu niedrożności dystalnej tętnicy środkowej mózgu. Sprzęt używany w konfiguracji do kraniotomii szczura pokazano dla prawej półkuli i wstawki, umiejscowienia aspiratora i kroplówki z solą fizjologiczną wokół miejsca kraniektomii. Pokazano również kluczowe cechy układu naczyniowego; Pokazano środkową tętnicę mózgową (czerwoną) i dolną żyłę mózgową (niebies...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Karprofen	Norbrook	Nr karty katalogowej; 02000/4229	podawać 0,25 mg/kg
Siarczan atropiny	AmTech	RXATRINJ-100
Waciki nasączone alkoholem	UHS	20021
Krem z lidokainą (Emla)	AstraZeneca	12901	Nałóż kroplę wielkości ziarnka grochu na ogoloną szyję i okolice skroniowe
System koców homeotermicznych	Instrumenty Harvarda	507222F
Kleszcze	Narzędzia Naukowe	11019-12
Izofluran	Abbott	B506
Szwy jedwabne	Aparatura harwardzka	723288
System kauteryzacji	Eschmann
0,25 mm Kleszczyki do kafterii jubilerskiej	Eschmann	8330349
cienkie kleszcze Dumont	Narzędzia Naukowe	11251-10
System kroplowy soli fizjologicznej napędzany kciukiem
System aspiratora Vacusafe	INTEGRA BIOSCIENCES	158320
16 mm gruboziarniste diamentowe zadziory stalowe		K801 104 016
Ręczna wiertarka dentystyczna	NSK	NSKVMAXVRE (Rękojeść NSKEX6B)
Nożyczki sprężynowe Vannas	Narzędzia Nauk Pięknych	15000-03
Nożyczki mikronaczyniowe	Światowe instrumenty precyzyjne	501790
4-0 Szwy Vicryl	Ethicon
Klips naczyniowy i aplikator
Mikroskop operacyjny	Zeiss
Kompaktowy system anestezjologiczny Isoflurane K/F Pojedynczy Gaz	Rozwiązania VetTech
Ostrza skalpela ze stali węglowej nr 10	Swann-Morton	201
25g igły	Terumo	NN-2525R
Strzykawki (1 ml i 5 ml)	Terumo	SS+01T1 / SS*05SE1
sól fizjologiczna (chlorek sodu 0,9%)	Fresenius Kabi	Pl 08828/0178
Patyczki higieniczne	Johnson i Johnson	5.00021E+12	wysterylizuj przed użyciem
Gaza			wysterylizuj przed użyciem