Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotuj strzykawkę do wstrzyknięcia
- Rozpuścić lizolecytynę w 1% roztworze w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS; pH 7,4) i przechowywać w temperaturze -20 °C w małych porcjach (75 μl). Rozmrozić fiolkę do temperatury pokojowej (RT).
UWAGA: Jeśli lizolecytyna nie jest rozpuszczona, sonikuj probówkę w myjce ultradźwiękowej (40 kHz) przez około 30 minut, aby uzyskać jednolity roztwór.
- Z naciągniętą szklaną kapilarą należy obchodzić się ze szczególną ostrożnością, aby uniknąć uszkodzenia delikatnej końcówki. Odkręć nakrętkę strzykawki iniekcyjnej o pojemności 10 μl i nakręć ją na płaski koniec kapilary, a następnie na dwie końcówki, upewniając się, że pasujące końce tulejek są wyrównane, a kapilara jest dobrze dopasowana do stożkowej tulejki (Rysunek 1). Przepłukać strzykawkę alkoholem izopropylowym i usunąć tłok. Po wyschnięciu należy ręcznie przykręcić igłę do strzykawki do wstrzykiwań.
- Przymocować metalową igłę piasty do strzykawki zalewającej. Przebij igłą gumowy krążek i zsuń go do podstawy. Napełnić strzykawkę zalewającą lizolecytyną. Delikatnie wcisnąć strzykawkę zalewającą, aż na końcu igły pojawi się płyn. Gwarantuje to, że pęcherzyki powietrza nie zostaną wprowadzone do strzykawki do wstrzykiwania.
- Włożyć metalową igłę piasty strzykawki zasysającej do strzykawki do wstrzykiwań. Wykonując mocne uszczelnienie za pomocą gumowego krążka, powoli wciskaj strzykawkę zalewającą, aż kapilara wypełni końcówkę roztworem. Ostrożnie wyjąć strzykawkę zalewającą, jednocześnie wciskając naciśnięcie, aby napełnić cylinder strzykawki do wstrzykiwania bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Włożyć tłok do strzykawki do wstrzykiwań i upewnić się, że roztwór wypływa z końcówki kapilary, gdy tłok jest delikatnie wciskany.
UWAGA: Jeśli w kapilarze lub strzykawce do wstrzykiwania widoczne są jakiekolwiek pęcherzyki powietrza, przygotowanie strzykawki należy powtórzyć od początku. Ciągły przepływ płynu w aparacie do wstrzykiwania ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia dokładnych objętości wtrysków.
- Podłączyć gotową strzykawkę do wstrzykiwania do ramienia stereotaktycznego mikromanipulatora. To ukończone urządzenie będzie w stanie wstrzyknąć 15-20 zwierząt, zanim będzie wymagało ponownego napełnienia.
- Wyrzucić pozostałą lizolecytynę ze strzykawki do zasysania. Kilkakrotnie wyjmij i wciśnij alkohol izopropylowy, a następnie odłącz metalową igłę piasty. Odczekać kilka godzin, aż pozostały alkohol izopropylowy w strzykawce gruntującej odparuje przed ponownym napełnieniem.
2. Przygotuj zwierzę do zabiegu chirurgicznego
UWAGA: Ta procedura jest opisana dla samic myszy C57BL/6 w wieku 8-10 tygodni.
- Znieczulić zwierzę za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia ketaminy (200 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) lub zgodnie z instytucjonalnymi przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Zaplanuj, aby zwierzę było pod narkozą przez około 1 godzinę, jeśli używasz znieczulenia do wstrzykiwań.
- Sprawdź, czy zwierzę jest głęboko znieczulone, mocno ściskając stopę. Odpowiednio znieczulone zwierzę nie zareaguje na uszczypnięcie.
- Za pomocą maszynki do strzyżenia ogol obszar o 2-3 cm2 po stronie grzbietowej zwierzęcia, blisko uszu. Uważaj, aby nie uszkodzić uszu.
- Wytrzyj obszar do czysta 70% etanolem nałożonym na gazik. Upewnij się, że wszystkie przycięte włosy zostały usunięte z tego obszaru. Zdezynfekuj obszar jodem.
- Nałóż wazelinę na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas całego zabiegu.
- Trzymaj zwierzę w ogrzewanej komorze rekonwalescencji do czasu, gdy będzie gotowe do rozpoczęcia zabiegu.
3. Wykonaj zabieg chirurgiczny
UWAGA: Zapewnij odpowiednią technikę aseptyczną na wszystkich etapach procedury. Obejmuje to właściwe używanie rękawiczek, siatek na włosy, masek i zasłon. Wszystkie narzędzia należy wysterylizować przed kontaktem ze zwierzęciem.
- Przenieś zwierzę do ramy stereotaktycznej, grzbietową stroną do góry, uniesioną w środkowej części złożonymi ręcznikami papierowymi, aby wyolbrzymić krzywiznę kręgosłupa. Przymocuj ramiona i ogon taśmą chirurgiczną i zabezpiecz głowę zaciskiem na ząb. Stabilizujące pręty uszne nie są konieczne do tej procedury.
- Za pomocą skalpela wykonaj 3-centymetrowe nacięcie w linii środkowej, zaczynając tuż pod uszami i przecinając w kierunku ogonowym.
- Zlokalizuj przegrodę między dwiema dużymi strukturami tłuszczowymi i użyj cienkich kleszczy w każdej ręce, aby je rozsunąć. Rozłóż retraktory, aby otworzyć pole operacyjne.
- Pod mikroskopem chirurgicznym zlokalizuj wydatny proces wzrostu kręgu piersiowego 2 (T2) (UWAGA: Ta cecha jest charakterystyczna dla szczepu myszy C57BL/6). Wykonaj tępe rozwarstwienie za pomocą zamkniętych nożyczek sprężynowych przez nakładającą się muskulaturę, aby lepiej uwidocznić T2. Za pomocą kleszczy wyczuj twarde powierzchnie kręgu piersiowego 3 (T3) i kręgu piersiowego 4 (T4), aby potwierdzić prawidłowe położenie anatomiczne.
- Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj płytkie boczne nacięcia (o głębokości 2-3 mm) tkanki łącznej między T3 a T4. Ze względu na naturalne odstępy między kręgami w górnej części klatki piersiowej kręgosłupa myszy, laminektomia nie jest konieczna, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Należy pamiętać, że zbyt głębokie nacięcie przebije i uszkodzi przewód.
UWAGA: Na tym etapie często występuje niewielki stopień krwawienia. W takim przypadku należy wbić włócznię z gąbki w ten obszar, aż krwawienie ustąpi (30-60 sekund).
- Wizualizuj rdzeń kręgowy. Zostanie pokryty grubą warstwą widocznej opony twardej, jeśli ta warstwa opony mózgowej nie zostanie jeszcze przecięta podczas odsłaniania pępowiny. Wydatne naczynie krwionośne biegnie ogonowo-rostralnie przez przybliżoną linię środkową rdzenia kręgowego.
UWAGA: Ten układ naczyniowy nie powinien być używany jako punkt orientacyjny dla linii środkowej. Zamiast tego odpowiednie oświetlenie powinno ujawnić granice istoty szaro-białej flankujące kolumnę grzbietową, które powinny być wykorzystane do oszacowania linii środkowej.
- Jeśli opona twarda pozostaje nienaruszona, wykonaj delikatne boczne skrobania metalową igłą o wadze 32 G, aż zostanie usunięta. Celem jest usunięcie opony twardej, nie przecinając pozostałych opon mózgowych, które nie są tak grube i trudniejsze do zobaczenia.
UWAGA: Uwolnienie płynu mózgowo-rdzeniowego wskazuje na naruszenie pajęczynówki, i chociaż może to nastąpić bez mechanicznego uszkodzenia tkanki, nagromadzony płyn mózgowo-rdzeniowy powinien zostać usunięty za pomocą gąbki, aby lepiej uwidocznić powierzchnię rdzenia.
- Przesunąć strzykawkę do wstrzykiwań na miejsce i powoli ją opuszczać, aż końcówka naczynia włosowatego ledwo dotknie rdzenia kręgowego bezpośrednio po obu stronach linii środkowej. Zablokuj ramię na miejscu.
- Użyj stopniowanych pomiarów ramienia stereotaktycznego w kierunku Z, aby wykonać pomiar pozycji bazowej. Od tego odczytu odejmij 1,3 mm. Użyj szybkiego i płytkiego ruchu w dół, aby przebić tkankę i ostrożnie opuść kapila, aż do osiągnięcia nowego pomiaru. Opcjonalnie: w razie potrzeby zmiany w kolumnie grzbietowej mogą powstać tym samym ruchem przebijającym w linii środkowej i na głębokości 0,3 mm.
UWAGA: Te wartości są specyficzne dla wstrzykiwania między T3 i T4. W przypadku podjęcia decyzji o wykonaniu wstrzyknięcia w innym miejscu rdzenia kręgowego, wartości te muszą pochodzić z dowolnego dostępnego atlasu mózgu myszy.
- Użyj mikromanipulatora, aby wtłoczyć lizolecytynę do istoty białej brzusznego rdzenia kręgowego. Wykonuj jeden obrót mikromanipulatora co 5 sekund przez 2 minuty, co daje końcową objętość 0,5 μl. Pozostaw kapilarnę na miejscu na dodatkowe 2 minuty, aby zapobiec cofaniu się roztworu, a następnie ostrożnie usuń kapilarę.
- Zawiąż pojedynczy szew w mięśniu/tkance tłuszczowej pokrywającej kręgosłup. Użyj nieprzerwanego szwu, aby zamknąć skórę. Nałóż więcej jodu na miejsce nacięcia.
- Umieść zwierzę w ogrzewanej komorze rekonwalescencji, aż wyzdrowieje, a następnie włóż je z powrotem do klatki. Leki przeciwbólowe należy stosować pooperacyjnie zgodnie z instytucjonalnymi przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Dodatkowa opieka pooperacyjna zwykle nie jest konieczna, ponieważ zwierzęta są w pełni zdolne do samodzielnego karmienia i picia, gdy tylko dojdą do siebie po znieczuleniu.
- Powtórz procedurę dla pozostałych zwierząt.
UWAGA: Przy wprawie, operacja może być zakończona w ciągu 10-15 minut na zwierzę, szczególnie z pomocą drugiej osoby wiążącej szwy. Ta sama szklana kapilara może być używana do około 15-20 operacji, zanim końcówka stanie się tępa i należy ją wymienić. Operacje kontrolne można wykonać identycznie, jak opisano, z wstrzyknięciem PBS do rdzenia kręgowego zamiast lizolecytyny. Nie zalecamy czyszczenia naczynek do wykorzystania w przyszłości.
