Metoda zadawania urazowego uszkodzenia mózgu z zamkniętą głową u Drosophila

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Katzenberger, R. J., i wsp., Metoda zadawania urazowego uszkodzenia mózgu w zamkniętej głowie u Drosophila. J. Vis. Exp. (2015).

Film demonstruje użycie urządzenia High-Impact Trauma (HIT) do wywołania urazowego uszkodzenia mózgu z zamkniętą głową (TBI) u Drosophila. TBI powoduje mechaniczny uraz mózgu wpływający na funkcje neuronów, co z czasem prowadzi do neurodegeneracji i śmiertelności.

Protokół

1. Budowa urządzenia HIT

Przymocuj sprężynę do deski za pomocą dwóch zacisków i czterech śrub (Rysunek 1A). Wyśrodkuj zaciski względem szerokości deski i dociśnij je do siebie zewnętrznym zaciskiem równo z krawędzią deski. Przed zamocowaniem zacisków zegnij je za pomocą szczypiec, aby ściśle przylegały do sprężyny.
UWAGA: Zobacz Tabela 1 po opisy materiałów wymaganych do budowy urządzenia HIT. Zaciśnięty koniec sprężyny powinien znajdować się 1/8 cala (3,2 mm) od krawędzi deski, a wolny koniec powinien wystawać ponad deskę na 3/4 cala (19 mm). Wyreguluj sprężynę tak, aby leżała równolegle do długości deski.
Owiń wolny koniec sprężyny raz dookoła paskiem samoprzylepnym pętli na rzepy. Zewnętrzna krawędź rzepu powinna być zlicowana z końcem sprężyny. Rzep jest ważny, ponieważ służy do mocowania fiolki do sprężyny poprzez stworzenie szczelnego złącza zaciskowego. Rzep umożliwia również łatwe podłączanie i wyjmowanie fiolek, co pozwala na przetworzenie wielu fiolek w krótkim czasie.
Umieść pokrywę wiaderka na lód do góry nogami, wyśrodkowaną, mocno przylegającą do drewnianej deski. Ustaw podniesiony obszar pokrywy pojemnika na lód tak, aby długa krawędź była równoległa do szerokości deski. Zwróć uwagę, że podniesiony obszar wiaderka na lód jest o 1/2 cala (13 mm) wyższy niż drewniana deska, więc gdy fiolka jest przymocowana do sprężyny, sprężyna nie będzie leżeć płasko na desce.
Dosuń całe urządzenie do stałego przedmiotu, takiego jak ściana, tak aby pokrywa pojemnika na lód była zaklinowana między deską a przedmiotem i nie przesuwała się.
Przyklej kątomierz papieru do spodu tekturowej tacki na fiolki muchowe i ustaw go na krawędzi przy długości deski, tak aby znak 90° był wyrównany ze sprężyną, gdy zostanie pociągnięty z powrotem do idealnie pionowej pozycji.

2. Działanie urządzenia HIT

Umieść od 1 do 60 znieczulonych much CO₂ w pustej fiolce i zakorkuj fiolkę za pomocą ciasno przylegającego wacika.
Ogranicz muchy do dna 1 cala (2.5 cm) fiolki, wciskając wacik do fiolki, aż znajdzie się 1 cal (2.5 cm) od dna. Pomocne jest narysowanie linii na fiolce w miejscu oznaczenia 1 cala (2,5 cm). Należy pamiętać, że ograniczanie much do większych lub mniejszych obszarów fiolki może wpływać na nasilenie fenotypów.
Poczekaj 5 minut, aż muchy odzyskają mobilność z CO₂. Należy zauważyć, że nie wiadomo, czy 5 minut wystarczy, aby całkowicie usunąć efekty CO₂.
Włożyć koniec sprężyny do fiolki, aż wewnętrzna krawędź rzepu zrówna się z górną częścią fiolki (Rysunek 1B). Gdy sprężyna leży płasko, 1 cal (2.5 cm) fiolki powinien zachodzić na podniesiony obszar pokrywy pojemnika na lód. Fiolki mogą być wielokrotnie używane.
Siedząc, trzymaj fiolkę w okolicy rzepów za pomocą kciuka i palca wskazującego lewej ręki. Przytrzymaj deskę mocno przy blacie prawej ręki. Alternatywnie użyj zacisków C, aby mocno przytrzymać deskę do blatu.
Pociągnij sprężynę idealnie prosto z powrotem pod żądanym kątem. Zwolnij sprężynę. Pozwól, aby wiosna całkowicie się zatrzymała.
Wyjąć fiolkę ze sprężyny i pozwolić muchom zregenerować się przez ≥5 minuty. Poddaj muchy kolejnemu uderzeniu lub przenieś muchy do fiolki z pokarmem dla much.
UWAGA: Różne testy mogą być użyte do oceny fenotypowych efektów uderzeń z urządzenia HIT. Na przykład wpływ na długowieczność można określić, analizując odsetek much, które przeżywają czasami po urazie, wpływ na morfologię mózgu można określić za pomocą analizy histologicznej głowy, a wpływ na ekspresję genów można określić za pomocą analizy ilościowej poziomów mRNA.
Określ efekty zabiegu, które nie są spowodowane braniami, identycznie traktując muchy kontrolne, które nie są poddawane ukłuciom. Nosić ochronniki słuchu, ponieważ uderzenie fiolki o pokrywę pojemnika na lód powoduje głośny dźwięk.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat urządzenia HIT. (A) Ilustracja widoku z góry urządzenia HIT w pozycji spoczynkowej. (B) Ilustracja widoku z boku urządzenia HIT. Sprężyna jest pokazana w pozycji spoczynkowej (ciemnoczerwona) i odchylona do 90° (jasnoczerwona).