Zakażenie płodowymi neuronalnymi komórkami macierzystymi wirusem Zika

Streszczenie

Źródło: McGrath, E. L., i wsp., Zakażenie wirusem Zika hodowanych komórek macierzystych neuronów mózgu ludzkiego płodu do analizy immunocytochemicznej. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje procedurę zakażenia ludzkich płodowych nerwowych komórek macierzystych wirusem Zika. Zainfekowane komórki mogą być wykorzystane do dalszych badań.

Protokół

1. Zakażenie wirusem Zika

UWAGA: ZIKV jest bardzo wrażliwy na temperaturę, dlatego konieczne jest przechowywanie zapasów ZIKV w temperaturze -80 °C i unikanie cykli zamrażania/rozmrażania. Kontynuuj pracę z porcjami na lodzie.

1. Komórki przejściowe. Do wysiewu 24-dołkowej płytki potrzebne są łącznie 3-4 miliony komórek, dlatego podczas pasażowania należy umieścić liczbę komórek potrzebną do infekcji i wysiewu w kolbie podczas pasażowania.
2. W przypadku wysiewu komórek na 24-dołkową płytkę w celu barwienia, należy przygotować płytkę [Pokryć studzienki zawierające szkiełka nakrywkowe 0,01% poli-D-lizyną (PDL) w sterylnej wodzie i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. W przypadku płytki 24-dołkowej należy użyć 250 μl PDL na dołek].
3. Po pasażowaniu umieścić 1 ml zawiesiny komórek w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie usunąć supernatant przez aspirację.
4. Ponownie zawiesić osad komórkowy w stadzie ZIKV, aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) od 1 do 10. Objętość roztworu ZIKV nie powinna przekraczać 0,5 ml. W przypadku leczenia próbnego (komórki kontrolne) należy ponownie zawiesić ogniwa w tej samej objętości i rodzaju pożywki, które są używane w stadzie ZIKV.
5. Inkubować nad mieszaniną komórka/ZIKV w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Odwróć probówkę 2-3 razy, a następnie odwiruj mieszaninę przez 5 minut przy 216 x g w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad komórkowy. Zawiesić osad w dPBS i ponownie odwirować przez 5 minut przy 216 x g w temperaturze pokojowej.
6. Usunąć supernatant przez aspirację, ponownie zawiesić komórki odpowiednią pożywką i załadować zakażone komórki do kolby lub płytki potrzebnej do przeprowadzenia eksperymentu. W przypadku wysiewu komórek na płytkę 24-dołkową należy ponownie zawiesić osad w 12 ml odpowiedniego podłoża, a następnie dodać 500 μl zawiesiny do każdej studzienki.
   UWAGA: W tym momencie albo utrzymuj komórki w pożywce wzrostowej, aby obserwować wpływ ZIKV na komórki macierzyste, albo przejdź do kroków 6 lub 7, aby zbadać wpływ ZIKV na proces różnicowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Gibco	11965-092
F12	Gibco	11765-054
Glukoza (10%)	Sigma	G8644
HEPES (1M)	Corning/cellgro	25-060-c1
Paciorkowiec (100x)	Gibco	15140-122
Inkubator dwutlenku węgla	Thermo Forma	Model# 3110
Wirówka	Thermo fisher Scientific	75004221
Szafa bezpieczeństwa biologicznego	Forma naukowa Claas II A/B3	Model# 1284
Bromowodorek poli-D-lizyny (PDL)	Sigma	P6407-5MG
Laminin	Invitrogen	23017-015