Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Określenie strefy zawału
- Zmierz strefę zawału (IZ) po 24 godzinach po zamknięciu tętnicy środkowej mózgu (MCAO).
nuta: Szczury, które straciły więcej niż 20% masy ciała lub rozwinęły się drgawki lub porażenie połowicze, są wykluczone z eksperymentu.
- Poddaj szczura eutanazji, zastępując wdychaną mieszaninę gazów 20% tlenem i 80% dwutlenkiem węgla, aż szczur przestanie spontanicznie oddychać.
- Otwórz klatkę piersiową z bocznym nacięciem o długości 5-6 cm przez ścianę brzucha pod klatką piersiową za pomocą nożyczek i kleszczy chirurgicznych.
- Wykonaj nacięcie przepony na całej długości klatki piersiowej za pomocą nożyczek i kleszczy chirurgicznych.
- Ostrożnie przesuwając płuca, przeciąć klatkę piersiową aż do obojczyka po prawej i lewej stronie.
- Wykonać perfuzję z 200 ml soli fizjologicznej przez lewą komorę serca.
- Nakłuć lub naciąć prawy przedsionek serca nożyczkami.
- Wykonaj dekapitację za pomocą gilotyny i zbierz tkankę mózgową.
- Za pomocą nożyczek do tęczówki przetnij od otworu wielkiego do dystalnej krawędzi tylnej powierzchni czaszki po obu stronach.
- Oddziel opuszki węchowe, połączenia nerwowe wzdłuż powierzchni brzusznej i grzbietowej czaszki od mózgu.
- Usuń mózg z głowy.
- Wyprodukuj 6 plasterków mózgu, tworząc poziome sekcje o grubości 2 mm za pomocą niepowlekanej, jednokrawędziowej żyletki ze stali nierdzewnej .009".
- Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w 0,05% TTC.
- Umieść tkankę mózgową na szkiełkach mikroskopowych i wykonaj skanowanie optyczne tych 6 wycinków mózgu z rozdzielczością 1600x1600 dpi (patrz na przykład rysunek 1).
- Dodaj niebieski filtr za pomocą edytora zdjęć (np. Adobe Photoshop CS2) za pomocą funkcji Mikser kanałów (Image > Adjustment > Channel Mixer) i zapisz obraz w formacie pliku JPEG.
>nuta: Po zastosowaniu niebieskiego filtra obraz będzie wyglądał w skali szarości.
- Otwórz zapisany obraz w ImageJ 1.37v.
nuta: Ten program komputerowy wykorzystuje funkcję progową do wyodrębniania i obliczania pikseli, które są czarne lub białe (patrz rysunek 2).
- Dla każdego z 6 wycinków mózgu na obrazie wybierz i zapisz każdą półkulę (prawą zranioną ipsilateralną i lewą nieuszkodzoną przeciwległą) jako osobny plik obrazu za pomocą narzędzia "wybór wielokątów" z menu głównego.
- Ustaw granicę określania IZ za pomocą funkcji automatycznego progu z menu głównego oprogramowania ImageJ, wybierając Image > Adjust > Threshold (Dostosuj obrazu i zmierz liczbę pikseli w każdej półkuli pojedynczego zestawu mózgowego.
>nuta: Na tym etapie można użyć makr w oprogramowaniu ImageJ (kod znajduje się w dokumencie uzupełniającym 1). Odcięcie jest krytycznym parametrem określającym, które piksele należy przekonwertować na biel, a które na czerń w zależności od odcienia szarości (patrz przykłady na rysunku 3 i rysunku 4). Następnie ImageJ porównuje białe i czarne piksele, aby określić IZ. W oparciu o protokół barwienia i ustawienia skanera zastosowaliśmy stałą wartość odcięcia wynoszącą 0,220.
- Wykonaj pomiar IZ korygując obrzęk tkanek przy użyciu metody Ratios of Ipsilateral and Contralateral Cerebral Hemispheres (RICH) (patrz przykład na rysunku 5).
nuta: Wielkość zawału ocenia się jako procent przeciwległej półkuli.
2. Określenie obrzęku mózgu
UWAGA: Użyj ImageJ 1.37v do pomiaru obrzęku mózgu (BE).
- Zmierz BE 24 godziny po MCAO. Do obliczenia BE należy użyć danych z objętości lewej i prawej półkuli (w jednostkach).
- Wykonaj skanowanie optyczne z rozdzielczością 1600x1600 dpi (patrz na przykład rysunek 1).
- Wybierz półkule mózgowe i ustaw granicę do określenia BE za pomocą ImageJ 1.37v, jak opisano powyżej w sekcjach 1.17-1.19.
- Powierzchnię BE należy wyrazić jako procent standardowych powierzchni nienaruszonej półkuli przeciwległej, obliczony metodą RICH przy użyciu następującego równania (patrz przykład na rysunku 5).
nuta: Zasięg BE ocenia się jako procent półkuli przeciwległej.
