Indukcja urazowego uszkodzenia mózgu w modelu szczurzym za pomocą bocznego urządzenia udarowego z płynem

Streszczenie

Źródło: McGuire, M. J., i inni. Wykorzystanie bezprzewodowego systemu wideo-EEG do monitorowania wyładowań padaczkowych po bocznym urazowym uszkodzeniu mózgu wywołanym płynem. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film pokazuje indukcję urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) u szczura za pomocą urządzenia do bocznego uszkodzenia płynu udarowego (FPI). Zabieg polega na wykonaniu otworu w czaszce znieczulonego szczura w celu odsłonięcia opony twardej, do której przymocowana jest kaniula. Szczur jest następnie podłączany do urządzenia, które generuje falę ciśnienia, która dociera do mózgu, naśladując TBI, powodując śmierć komórek nerwowych i uszkodzenie naczyń krwionośnych

Protokół

1. Płynna kontuzja udarowa

1. Noś fartuch laboratoryjny lub fartuch chirurgiczny, maskę chirurgiczną, rękawice chirurgiczne i nakrycie głowy oraz sterylizuj wszystkie narzędzia i materiały, które mają kontakt z miejscem operacji.
2. Znieczulenie 10-12-tygodniowego samca szczura rasy Wistar (350-400 g) za pomocą 3% izofluranu i 1 l/min tlenu w komorze indukcyjnej o odpowiedniej dla szczurów wielkości. Wyjmij szczura z komory indukcyjnej i przenieś go do obszaru przygotowania, gdy straci przytomność. Wlej sterylną maść okulistyczną do obu oczu.
3. Ogol włosy na głowie szczura za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia z ostrzem #40 od tuż nad oczami do ogonowej podstawy uszu, aby uzyskać wystarczające pole operacyjne. Usuń luźne, przycięte włosy z witryny.
4. Oczyść miejsce operowane, nakładając na ogoloną skórę głowy peeling chloroheksydynową 2%, a następnie 70% etanolu. Zacznij od środka i przesuwaj się na zewnątrz koncentrycznymi kręgami od miejsca nacięcia. Powtórz ten proces 3 razy. Nałóż roztwór Betadine na miejsce w ten sam sposób i pozostaw do wyschnięcia.
5. Umieść znieczulonego szczura w ramie stereotaktycznej i utrzymuj znieczulenie na poziomie 2-3% izofluranu-1 l / min tlenu przez nosecone. Sprawdź, czy nie ma utraty odruchu wycofania kończyny tylnej i utraty odruchu powiekowego, aby upewnić się, że szczur znajduje się w chirurgicznej płaszczyźnie znieczulenia.
6. Monitoruj częstość oddechów, tętno, temperaturę ciała i nasycenie tlenem przez cały czas trwania operacji. Utrzymuj tętno w zakresie 300-400 uderzeń na minutę, a SpO₂ powyżej 90%.
   UWAGA: Pulsoksymetr przymocowany do tylnej stopy może być używany do zapewnienia stałego odczytu tętna i SpO₂. Tętno powyżej 400 uderzeń na minutę wskazuje, że szczur nie jest wystarczająco znieczulony. Samoregulująca podkładka rozgrzewająca, sprzężona z termometrem doodbytniczym, ustawiona na 37 °C, może być umieszczona pod szczurem przez cały czas trwania operacji, aby utrzymać temperaturę ciała. Mikroskop stereoskopowy ze źródłem światła w połączeniu z lampą światłowodową jest pomocny w wizualizacji zabiegu.
7. Za pomocą igły o wadze 23 g wstrzyknąć śródskórnie 0,5% chlorowodorku bupiwakainy w skórę głowy w miejscu nacięcia w celu znieczulenia miejscowego na 10 - 15 minut przed wykonaniem nacięcia.
8. Wykonaj 1,5-2,5 cm nacięcie w linii środkowej przez skórę i mięśnie skóry głowy za pomocą ostrza skalpela #10. Cofnij skórę i mięśnie, aby odsłonić czaszkę i zapewnić czyste pole operacyjne. Odbij leżącą pod spodem powięź i tkankę tłuszczową z dala od kości za pomocą sterylnych wacików.
   UWAGA: Elektryczna jednostka kauteryzująca jest przydatna do osiągnięcia szybkiej hemostazy.
9. Ogolić boczny grzbiet lewej kości ciemieniowej za pomocą kirety chirurgicznej, aby uzyskać gładką płaską powierzchnię, tak aby podstawa żeńskiej piasty Luer lock mogła spoczywać równo z czaszką.
10. Przepłukać powierzchnię czaszki i otaczające tkanki roztworem gentamycyny o stężeniu 2,0 mg/ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej. Zetrzyj nadmiar roztworu sterylnym wacikiem.
11. Nałóż 3% nadtlenek wodoru na czaszkę, aby wysuszyć kość.
    UWAGA: Jeśli kość nie jest wystarczająco sucha, cement dentystyczny nie będzie prawidłowo przylegał i nie utworzy solidnego uszczelnienia.
12. Stworzyć miejsce kraniektomii o średnicy 5 mm przez lewą kość ciemieniową.
    UWAGA: Wiertło trepanacyjne umieszczone w wiertarce przymocowanej do ramy stereotaktycznej może być pomocne w zainicjowaniu kraniektomii. Użyj wiertarki ręcznej z trepanacją o średnicy 5 mm, aby powoli zakończyć kraniektomię przez pozostałą kość. Gdy zbliżasz się do zakończenia kraniektomii, obróć trepanację w odwrotnym kierunku, aby zapobiec pęknięciu leżącej pod nią opony twardej. Czaszka zostanie przerzedzona na obwodzie dysku, a płat czaszki będzie luźny po lekkim naciśnięciu.
13. Usuń płat kostny za pomocą kirety chirurgicznej i kleszczy do tkanek gładkich.
    UWAGA: Może wystąpić pewne krwawienie, ale hemostazę można szybko osiągnąć, delikatnie uciskając sterylnymi wacikami.
14. Użyj mikroskopu stereoskopowego i oświetlenia, aby wizualnie sprawdzić oponę twardą pod kątem oznak pęknięcia. Cienka obwódka kości pozostanie na obwodzie miejsca kraniektomii. Delikatnie usuń tę obręcz za pomocą kleszczyków do tkanek gładkich, uważając, aby nie rozerwać opony twardej.
15. Przetrzyj czaszkę 70% etanolem, aby usunąć pył kostny i wysuszyć czaszkę.
16. Nałóż cienką warstwę kleju w żelu cyjanoakrylowym wokół dolnej krawędzi piasty Luer lock i przymocuj ją do czaszki nad kraniektomią, nie blokując otworu. Zachowaj ostrożność, aby nie dopuścić do kontaktu kleju z oponą twardą. Ponadto uszczelnij zamek Luer dodatkową cienką warstwą kleju wokół zewnętrznej podstawy piasty.
17. Przygotuj zawiesinę cementu dentystycznego. Nałóż cement na powierzchnię czaszki wokół i nad podstawą piasty Luer lock, aby zabezpieczyć ją na miejscu.
18. Napełnij piastę Luer lock sterylnym, wolnym od konserwantów roztworem sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) (pH 7,4) za pomocą strzykawki i igły, tak aby nad górną częścią obręczy był widoczny wypukły bolus soli fizjologicznej.
    UWAGA: Roztwór utrzyma oponę twardą w stanie wilgotnym podczas wysychania cementu dentystycznego, a także służy jako wskaźnik integralności uszczelki. Jeśli poziom roztworu w ogóle spadnie, oznacza to nieszczelność systemu i należy zdjąć i wymienić blokadę Luer.
19. Gdy cement dentystyczny zostanie całkowicie utwardzony, przerwij znieczulenie gazowe i usuń szczura z ramy stereotaktycznej.
20. Umieść szczura na platformie obok urządzenia FPI.
21. Urządzenie FPI ma zakrzywioną metalową końcówkę, która wystaje z przetwornika ciśnienia na końcu zbiornika płynu. Przymocuj rurkę ciśnieniową o długości 12 cm do końca zakrzywionej końcówki, tak aby przeciwległy koniec kończył się 2-centymetrowym męskim złączem skręcanym Luer lock. Przymocuj szczura do urządzenia FPI, podłączając żeński koniec piasty na czaszce szczura do męskiego złącza.
    UWAGA: Upewnij się, że połączenie jest szczelnie zabezpieczone i że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte z systemu.
22. Umieść zwierzę w pozycji leżącej mostka i wielokrotnie sprawdzaj, czy nie powrócił odruch wycofania. Gdy tylko szczur odzyska odruch odstawienia, ale nadal jest pod wpływem środków uspokajających, zwolnij wahadło urządzenia FPI, aby wywołać pojedynczy impuls ciśnienia 20 ms i wywołać obrażenia.
    UWAGA: Ważne jest, aby nie wywoływać urazu, gdy zwierzę jest głęboko znieczulone, ponieważ powoduje to zwiększoną śmiertelność z powodu obrzęku płuc wywołanego neurogennie. Wszystkie urządzenia wykazują zmienność. Jednak na urządzeniu użytym w tym eksperymencie, ustawienie młotka pod kątem 17° wytwarza impuls ciśnienia atmosferycznego o sile 2,2 - 2,3. Nieranne, pozorowane zwierzęta poddawane są tym samym procedurom, z wyjątkiem rzeczywistego impulsu płynu do wywołania urazu.
23. Po urazie należy natychmiast odłączyć szczura od urządzenia FPI, umieścić go w pozycji leżącej mostka i dostarczyć dodatkowy tlen (1 l/min) przez stożek nosowy, aż do powrotu spontanicznego oddychania. Bezdech jest przewidywaną konsekwencją urazu. W razie potrzeby wykonuj okresowe oddechy manualne przez maskę z zaworem workowym, aż szczur zacznie spontanicznie oddychać samodzielnie.
    UWAGA: Zazwyczaj bezdech trwa krócej niż 2 minuty. Przemijający szybki wzrost częstości akcji serca (>500 uderzeń na minutę) obserwuje się natychmiast po podaniu impulsu ciśnieniowego z powodu wybuchu katecholamin. Można to monitorować za pomocą pulsoksymetru przymocowanego do stopy szczura i może służyć jako możliwy wskaźnik, że doszło do poważnego urazu.
24. Monitoruj szczura w sposób ciągły i rejestruj czas powrotu odruchu prostowania (stabilne poruszanie się na wszystkich czterech kończynach).
25. Wielkość impulsu ciśnienia atmosferycznego dla każdego szczura powinna mieścić się w odległości ± 0,05 atmosfery od siebie. Upewnij się, że każdy z impulsów ciśnienia wytwarza płynny sygnał na oscyloskopie o stałej amplitudzie i czasie trwania.
    UWAGA: Głośny sygnał może wskazywać na pęcherzyki powietrza w systemie, które muszą zostać usunięte przed dostarczeniem impulsu urazu. Impulsy ciśnienia atmosferycznego, które powodują poważne obrażenia, w tym eksperymencie, to te, które zwykle skutkują czasem prawowania zwierząt wynoszącym 30-60 minut. Ten zakres czasów prostowania wiąże się ze śmiertelnością wynoszącą około 40-50%).
26. Podawać podskórnie 10 ml podgrzanej soli fizjologicznej jako leczenie wspomagające.
27. Umieść szczura w jego klatce domowej i pozwól mu dojść do siebie przez co najmniej 4 godziny.
    UWAGA: Zaobserwowano zwiększoną śmiertelność, gdy szczury są natychmiast ponownie poddawane narkozie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wiertła 1,00 mm	Miasto wierteł: Nowe narzędzia z węglików spiekanych	05M200
3M ESPE Durelon Cement karboksylowy	3M , Neuss Niemcy	38019	Cement dentystyczny
4-0 Szew	Ethicon, Sommerville, NJ	K831H	4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), czarny pleciony niewchłanialny szew
Średnica zewnętrzna 5 mm trepanina	Narzędzia Nauk Ścisłych	18004-50
Dumont #6 Kleszcze	Narzędzia Nauk Pięknych	11260-20
Kleszcze Dumont #7b	Narzędzia Naukowe	11270-20
ecgAUTO	EMKA Technologies, Kościół Upadków, Wirginia
Łącznik z gwintem wewnętrznym Luer Przezroczysty poliwęglan	Instrument Cole'a-Palmera	SKO#45501-22	Zamów partię #214271
Wiertarka nożna	Grobet USA, Carlstadt, NJ	Model C-300
GentaMax 100 (gentamycyna, roztwór siarczanu)	Phoenix, wyprodukowany przez Clipper Distributing Company LLC, St. Józef, MO		NDC 57319-520-05
Hill's Prescription Diet a/d Ps/ Kot	Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS
Oprogramowanie IOX2	EMKA Technologies, Kościół Upadków, VA
Izofloran, USP	Piramal Enterprise Limited, Andhra, Indie		NDC 66794-013-25
Aparat anestezjologiczny IsoTech	SurgiVet	WWV9000
Boczny układ FPI	AmScien	302	zakrzywiona końcówka z przedłużeniem rurki ciśnieniowej. podłączany za pomocą złącza śrubowego (Cole-Palmer; #4550-22)
Mikroskop stereoskopowy Leica A60	Leica Biosystems, Richmond, Wirginia	Numer części: 10 450 488
Marcaina (0,5%) Bupiwakaina hcl do wstrzykiwań usp 5 mg/ml	Hospira, Las, Jezioro, IL	CA-3627	50 ml fiolka wielodawkowa; NDC 0409-1610-50
Kleszcze Micro-Adson	Narzędzia Naukowe	11018-12
Uchwyty igieł Olsen-Hegar z obcinaczami do szwów	Narzędzia Naukowe	12002-14
Cement kostny PALACOS R+G z gentamycyną	Heraeus,	REF: 5036964	Nieprzepuszczający promieni rentgenowskich cement kostny zawierający 1 x 0,5 g gentamycyny
Roztwór powidonu jodu			Betadine
Maść weterynaryjna Puralum	Produkty weterynaryjne Dechra, Overland Park KS		NDC 17033-211-38
Ostrze skalpela (#10) i uchwyt	Integra Miltex, York, PA	NR REF.: 4-110
Rękojeść skalpela - #4	Narzędzia Nauk Pięknych	10004-13
Nóż do sierpa	Bausch + Lomb Storz Instruments	N1705 HM	Zakrzywione ostrze 5 mm. Okrągły uchwyt. Długość całkowita 168mm, 6.6 cali.
Mikrolustro Silverstein	Bausch + Lomb Storz Instruments	N1706 S8	Średnica 3mm. Kąt nachylenia 45 stopni. Długość całkowita 180mm, 7.2 cali
Jednostka kauteryzacji termicznej	Geiger Technologia Medyczna, Blefy Rady Delasco, IA	Model nr: 150
Vetivex	Produkty weterynaryjne Dechra, Overland Park KS		Weterynaryjne pHyLyteTM pH do iniekcji 7.4 (Wstrzykiwanie wielu elektrolitów, typ 1, USP)
Szczury Wistar IGS	Rzeka Charles	kod szczepu 003	12 tygodni w momencie urazu
Zwijacz Wullstein	Narzędzia Nauk Pięknych	17018-11