Eksperymentalna indukcja jaskry przez niedrożność kąta tęczówkowo-rogówkowego w modelu mysim

Streszczenie

Źródło: Bunker, S., et al. Jaskra eksperymentalna wywołana wstrzyknięciem mikrosfer magnetycznych do oka. J. Vis. Exp. (2015)

W tym filmie znieczulony szczur przechodzi zabieg okulistyczny, w którym kulki magnetyczne są wstrzykiwane do przedniej komory pod wpływem pola magnetycznego w celu zablokowania kąta tęczówkowo-rogówkowego. Blokada ta blokuje siatkę beleczkową, uniemożliwiając drenaż cieczy wodnistej i prowadząc do wzrostu ciśnienia wewnątrzgałkowego, uszkadzając komórki zwojowe siatkówki i nerw wzrokowy. W ten sposób rozwija się stan podobny do jaskry.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Indukcja nadciśnienia ocznego

1. Wywołanie eksperymentalnej jaskry poprzez podniesienie ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) poprzez jednostronne wstrzyknięcie mikrosfer paramagnetycznych do przedniej komory szczurów rasy Brown Norway. Inne pigmentowane szczury mogą być odpowiednie, chociaż użytkownik musiałby je najpierw zweryfikować.
2. Trzymaj 250-300 g samic szczurów rasy Brown Norway w stałym środowisku o słabym oświetleniu (40-60 luksów), aby zminimalizować dobowe wahania ciśnienia wewnątrzgałkowego, z dostępem do pożywienia i wody.
3. Wykonaj podstawowe pomiary ciśnienia wewnątrzgałkowego u obudzonych zwierząt8 przed znieczuleniem i wstrzyknięciem kulek, używając tonometru odbicia skalibrowanego do użytku w oku szczura9. IOP przyjmuje się jako średnią z pięciu odczytów.
4. Znieczulenie szczurów 37,5 mg/kg ketaminy i 0,25 mg/kg chlorowodorku medetomidyny podawanych dootrzewnowo. Potwierdź głębokość znieczulenia, badając odruchy tylnej stopy zwierzęcia przed zastosowaniem jodu powidonu (patrz krok 1.5) i wstrzyknięciem kulki (patrz krok 1.8). Podawać 0,5% chlorowodorek proparakainy w celu znieczulenia.
   UWAGA: Nie rozszerzaj źrenicy na żadnym etapie. Pomoże to koralikom lepiej osadzić się w kącie tęczówkowo-rogówkowym i zapobiegnie wiązaniu się z soczewką. Zastosuj maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki na nieoperowanym oku przeciwległym.
5. Przemyć oko operacyjne 5% jodonem powidonu w wodzie na 5 minut przed wstrzyknięciem.
6. Po 5 minutach odciąć jod powidonu za pomocą sterylnej gazy i przemyć oko 0,9% sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Utrzymuj oko wilgotne podczas znieczulenia dzięki regularnemu stosowaniu sterylnej soli fizjologicznej.
7. Umieść magnes toroidalny wokół oka.
8. Wstrzyknąć 25 μl roztworu zawierającego 30 mg/ml wysterylizowanych promieniowaniem gamma mikrosfer magnetycznych o wielkości 8 μm w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) do komory przedniej za pomocą igły ze skosem 33 G.
   1. Aby przygotować kulki, przemyć przez ponowne zawiesinie, a następnie odwirować 3 razy przy 10 000 x g przez 5 minut z 1 ml HBSS przed przygotowaniem końcowego roztworu 30 mg/ml. Utrzymuj sterylne warunki przez cały czas.
   2. W przypadku wstrzykiwania należy uważać, aby nie wkładać igły do tęczówki, aby zminimalizować ryzyko urazu tęczówki. Można temu zapobiec, ustawiając igłę stycznie do powierzchni rogówki, jak najbardziej równolegle do tęczówki. Pomoże to również zminimalizować utratę ściegu w miejscu wstrzyknięcia.
      UWAGA: Wstrzykuj koraliki w szybkim tempie, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie wokół kąta tęczówki i rogówki, co ma kluczowe znaczenie dla podniesienia ciśnienia wewnątrzgałkowego. Dodatkowo koraliki, igły i pierścienie magnetyczne należy przechowywać oddzielnie, aby koraliki nie tworzyły skupisk, co utrudniało ich załadowanie do strzykawki i wstrzyknięcie, a igła nie uległa namagnesowaniu.
9. Pozostawić igłę na miejscu przez 1 minutę po wstrzyknięciu, aby upewnić się, że kulki osiądą w kącie tęczówki i rogówki, aby utrudnić wodny drenaż z siatki beleczkowej. Lekko pochyl igłę po początkowym osiadaniu koralików, aby umożliwić pewien wyciek wody wodnej, aby zminimalizować przejściowy wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego. Pod koniec operacji przepłucz igłę najpierw solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), następnie 70% etanolem, a następnie wodą destylowaną, aby zapewnić dalsze używanie igły w oddzielnych procedurach. Alternatywnie można użyć jednorazowych igieł, jeśli dostępna jest odpowiednia kombinacja miernika i strzykawki. Opcjonalnie: igły mogą być ostrzone za pomocą ukosowarki, aby przedłużyć ich użytkowanie.
10. Na tym etapie, jeśli to konieczne, usuń magnes i użyj go do narysowania koralików w obszarach o niepełnym pokryciu.
11. Pozostaw magnes na miejscu wokół oka przez kolejne 10 minut po wstrzyknięciu, aby upewnić się, że kulki dobrze przylegają do kąta tęczówkowo-rogówkowego.
12. Znieczulenie odwrotne przy użyciu 0,25 mg/kg chlorowodorku atypemezolu.
13. Podawać chloramfenikol lub inną maść z antybiotykiem, na przykład gentamycynę lub terramycynę miejscowo, aby zapobiec infekcji, oraz 0,5% chlorowodorek proparakainy w celu znieczulenia. Pozostaw zwierzęta do regeneracji na macie grzewczej, aż odzyskają ruch, a następnie przenieś je do ciepłego pudełka i zapewnij im dodatkowe składniki odżywcze, takie jak suplement diety lub regularna dieta nawilżana, aż do całkowitego powrotu do zdrowia. Zwierzętom wykazującym objawy bólu należy podać anieból ogólnoustrojowy lub miejscowy po 24 godzinach od zabiegu. Jeśli objawy te utrzymują się pomimo leczenia, zwierzęta powinny zostać poddane humanitarnemu ubojowi.
14. Użyj przeciwległego oka jako nieobsługiwanego elementu sterującego.
15. Wykonuj pomiary ciśnienia wewnątrzgałkowego co 2-3 dni po podaniu koralików, a następnie co 2-3 dni za pomocą tonometru odbicia skalibrowanego do użytku w oku szczura.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
250-300g samice były szczura hodowlanego rasy brązowej Norwegii	Harlan Wielka Brytania	203
Tonometr odbicia Tonolab	Tiolat	TV02
Ketaset (ketamina)	Fort Dodge Zdrowie zwierząt	BN1000118	37,5 mg/kg
Domitor (chlorowodorek medetomidyny)	Orion Pharma	140-999	0,25 mg/kg
Jod powidonu	Ecolab	BN4369LE10	5% w H2O
Roztwór soli fizjologicznej Minima	Bausch i Lomb	PL00033/5017
Magnes toroidalny	Supermagnete	Przekaźnik Przemysłowy R-10-07-03-N
Mikrosfery magnetyczne	Laboratoria Bangs	UMC4N/9692
HBSS	Invitrogen	14025
igła skośna o rozmiarze 33	Hamilton	7747-01	Igła niestandardowa
Strzykawka z końcówką typu luer	Hamilton	80601
Antisedan (chlorowodorek atypemozolu )	Orion Pharma	141-003	0,25 mg/kg
Maść chloramfenikolowa	Medicom	18956-0005