Obrazowanie żywych komórek Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej

Podsumowanie

Niniejszy protokół przedstawia szczegółową procedurę monitorowania zachowania pojedynczych komórek różnych bakterii w czasie, z wykorzystaniem zautomatyzowanej fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej. Ponadto przedstawiamy wytyczne dotyczące analizy uzyskanych obrazów mikroskopowych.

Streszczenie

W ciągu ostatnich kilku lat naukowcy coraz bardziej uświadamiają sobie, że średnie dane uzyskane z eksperymentów opartych na populacjach drobnoustrojów nie są reprezentatywne dla zachowania, stanu lub fenotypu pojedynczych komórek. W związku z tym nowym spostrzeżeniem liczba badań nad pojedynczymi komórkami stale rośnie (nowsze przeglądy literatury zob. ^1,2,3). Jednak wiele stosowanych technik analizy pojedynczych komórek nie pozwala na monitorowanie rozwoju i zachowania jednej, konkretnej komórki w czasie (np. cytometria przepływowa lub standardowa mikroskopia).

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy szczegółowy opis metody mikroskopowej wykorzystanej w kilku niedawnych badaniach ^{4, 5, 6, 7}, która umożliwia śledzenie i rejestrowanie (fluorescencji) pojedynczych komórek bakterii Bacillus subtilis oraz Streptococcus pneumoniae podczas wzrostu i podziałów przez wiele pokoleń. Powstające w ten sposób filmy mogą służyć do konstruowania drzew filogenetycznych poprzez odtwarzanie historii pojedynczej komórki w populacji wywodzącej się od jednego wspólnego przodka. Ta metoda mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse może być wykorzystana nie tylko do badania wzrostu, podziału i różnicowania pojedynczych komórek, ale także do analizy wpływu historii i pochodzenia komórki na określone zachowania komórkowe. Ponadto mikroskopia time-lapse idealnie nadaje się do badania dynamiki ekspresji genów oraz lokalizacji białek podczas cyklu komórkowego bakterii. Metoda ta wyjaśnia, jak przygotować komórki bakteryjne i przygotować szkiełko mikroskopowe, aby umożliwić rozwój pojedynczych komórek w mikrokolonię. W skrócie, pojedyncze komórki nanosi się na powierzchnię półstałą, składającą się z pożywki wzrostowej uzupełnionej agarozą, na której rosną i dzielą się pod mikroskopem fluorescencyjnym w komorze środowiskowej z kontrolą temperatury. Obrazy są rejestrowane w określonych odstępach czasu, a następnie analizowane przy użyciu oprogramowania o otwartym kodzie źródłowym ImageJ.

Protokół

1. Przygotowanie kultur B. subtilis

1. Zaszczepić komórki z zamrożonych zapasów (-80°C) w 10 ml pożywki do mikroskopii poklatkowej (TLM) (62 mM K₂HPO₄, 44mM KH₂PO₄, 15 mM (NH₄)₂SO₄, 6,5 mM cytrynianu sodu, 0,8 mM MgSO₄, 0,02 % kwasów kazeinowych, 27,8 mM glukozy, 0,1 mM L-tryptofanu, pH ustawione na 7 za pomocą roztworu KOH), uzupełnionej w razie potrzeby o antybiotyki.
2. Hodować komórki przez noc w kolbie z wytrząsaniem (30°C, 225 rpm).
3. Następnego ranka rozcieńczyć komórki w stosunku 1:10 w uprzednio ogrzanej chemicznie zdefiniowanej pożywce (CDM) (62 mM K₂HPO₄, 44mM KH₂PO₄, 15 mM (NH₄)₂SO₄, 6,5 mM cytrynianu sodu, 0,8 mM MgSO₄, 2,2mM glukozy, 2,1 mM kwasu L-glutaminowego, 6 μM L-tryptofanu, 7,5 μM MnCl₂, 0,15 x mieszaniny metali (przygotować 50x roztwór zapasowy mieszaniny MT (ref ⁸), zawierający: 0,2 M MgCl₂, 70 mM CaCl₂, 5 mM MnCI₂, 0,1 mM ZnCl₂, 0,2 mM chlorowodorku tiaminy, 2 mM HCl, 0,5 mM FeCl₃ (dodać na końcu)) bez antybiotyków.
4. Hodować komórki B. subtilis do środkowej fazy wykładniczej (30°C, 225 rpm). Zazwyczaj zajmuje to około czterech godzin. Ważne jest, aby przygotować preparat z agarozy na godzinę przed osiągnięciem przez komórki środkowej fazy wykładniczej (patrz sekcja 2).
5. Zmierzyć absorbancję hodowli przy 600nm (A₆₀₀) i rozcieńczyć komórki do wartości A₆₀₀ około 0,035 za pomocą pożywki CDM. Taka gęstość optyczna (OD) zapewnia naniesienie pojedynczych komórek z odpowiednimi odstępami na szkiełko mikroskopowe do mikroskopii poklatkowej.

2. Przygotowanie preparatu do badania mikroskopowego (patrz również Rysunek 2)

Na jedną godzinę przed osiągnięciem przez komórki środkowej fazy wzrostu wykładniczego, przygotuj szkiełko mikroskopowe w następujący sposób:

1. Oczyść dwa szkiełka przedmiotowe (np. Knittel Glass, 7,6 x 2,6 cm) za pomocą 70% etanolu i wody.
2. Pobierz ramkę do genów (gene frame; ABgene; 1,7 x 2,8 cm) i ostrożnie usuń jedną z folii plastikowych z ramki, uważając, aby nie doprowadzić do rozłączenia plastikowej osłony po drugiej stronie ramki.
3. Przymocuj ramkę do genów do środka jednego z szkiełek, najpierw ułatwiając kontakt tylko po jednej stronie, a następnie prowadząc przymocowanie pozostałej części ramki za pomocą paznokcia. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza podczas przymocowywania ramki do szkiełka.
4. Użyj mikrofalówki, aby rozpuścić 150 mg (1,5%) wysokorozdzielczej agarozy niskotopliwej (Sigma) w 10 ml CDM. Agaroza musi zostać całkowicie rozpuszczona, aby uzyskać minimalne tło wymagane do eksperymentów z mikroskopii poklatkowej. W razie potrzeby w tym momencie uzupełnij agarozę-CDM induktorem lub innymi związkami.
5. Przenieś 500 μl ciepłej agarozy-CDM na środek ramki do genów. Upewnij się, że cały obszar, w tym krawędzie, jest całkowicie pokryty.
   Kolejne kroki (2.6 - 2.10) muszą zostać wykonane szybko, aby zapobiec nadmiernemu wysychaniu agarozy-CDM.
6. Połóż drugie szkiełko przedmiotowe na ramce do genów wypełnionej agarozą-CDM. Staraj się unikać pęcherzyków powietrza. Umieść tak przygotowane szkiełka w pozycji poziomej na 45 min w temperaturze 4°C w lodówce, aby umożliwić wystarczające zestalenie się agarozy-CDM.
7. Ostrożnie zsuń górne szkiełko przedmiotowe. Użyj żyletki, aby wyciąć wewnątrz ramki do genów paski agaru o szerokości ~5 mm, na których będą hodowane komórki. Na jednym szkiełku można zastosować maksymalnie trzy paski, oddzielone od siebie przerwami o szerokości ~4 mm po każdej stronie. Przestrzenie te zapewnią dopływ powietrza, który jest niezbędny do wzrostu B. subtilis. Jeśli konieczne jest śledzenie w czasie czterech różnych szczepów, można wykonać dwa paski i przeciąć je na pół, aby uzyskać cztery małe kwadraty. Usuń wszelkie pozostałości stałej pożywki.
8. Ostrożnie usuń drugą i ostatnią plastikową osłonę z ramki do genów, aby odsłonić jej lepką stronę.
9. Nanieś pojedyncze komórki (z kroku 1.5) na stałą pożywkę, nie dotykając jej końcówką pipety. Użyj 2,5 μl na cały pasek lub 1 μl na mały kwadrat. Zawsze zaczynaj od góry podkładki agarowej i pozwól cieczy rozprzestrzenić się równomiernie na przypisanym obszarze wzrostu, obracając szkiełko w górę i w dół. Szkiełko jest gotowe, gdy krawędzie cieczy staną się pofalowane, a ruch cieczy przestanie być widoczny podczas obracania szkiełka.
10. Połóż czyste szkiełko cover slip (24 x 50 mm) na ramce do genów, przesuwając je z jednej strony na drugą (unikaj pęcherzyków powietrza). Zapewnij całkowite przyleganie, dociskając cover slip wzdłuż ramki do genów paznokciem. Jeśli cover slip zostanie położony na komórkach bez umożliwienia im odpowiednio długiego wyschnięcia, komórki mają tendencję do przerastania się podczas eksperymentu. Należy również uważać, aby nie czekać zbyt długo przed nałożeniem cover slip, ponieważ agaroza stanie się wtedy zbyt sucha.
11. Podgrzej szkiełko wstępnie przez 1 h w temperaturze 30°C. Gdyby szkiełko zostało umieszczone bezpośrednio w wstępnie podgrzanej komorze środowiskowej (patrz krok 3.1) mikroskopu, wahania temperatury mogłyby spowodować problemy z autofokusem w pierwszych godzinach eksperymentu.

3. Mikroskopia fluorescencyjna z rejestracją czasową (patrz również Rysunek 3 i Film 1)

1. W odpowiednim czasie podgrzej komorę środowiskową (w naszym przypadku co najmniej 2h przed rozpoczęciem eksperymentu), aby zapobiec problemom z autofokusem po starcie doświadczenia. Wymagany czas zależy od zastosowanej komory środowiskowej, systemu grzewczego oraz mikroskopu.
2. Wybierz odpowiedni obiektyw, filtry i lustro dichroiczne zgodnie z konfiguracją eksperymentalną. W przypadku długich eksperymentów upewnij się, że między źródłem światła a próbką umieszczony jest filtr UV. Jeśli to możliwe, ogranicz również część światła wzbudzenia za pomocą filtrów neutralnych, aby zminimalizować ekspozycję.

W eksperymentach z wykorzystaniem mikroskopii time-lapse opublikowanych w pracy de Jong et al. 2010 ⁵ wykorzystano następujący sprzęt (dostarczony przez DeltaVision, UK): mikroskop IX71 (Olympus), kamerę CoolSNAP HQ2 (Princeton Instruments), źródło światła ksenonowego 300W, obiektyw do jasnego pola 60x (1,25 NA), zestaw filtrów GFP (Chroma, wzbudzenie 470/40 nm, emisja 525/50 nm) oraz zestaw filtrów mCherry (Chroma, wzbudzenie 572/35 nm, emisja 632/60 nm). Autofokus przeprowadzono przy użyciu światła diaskopowego oraz rutyny autofokusa dostępnej w oprogramowaniu Softworx firmy Deltavision. Należy zauważyć, że obecnie dostępne są również inne odpowiednie systemy autofokusu, takie jak Zeiss Definite Focus, Nikon Perfect Focus System oraz Leica Adaptive Focus Control.

3. Zaprogramuj eksperyment zgodnie z zastosowaną konfiguracją doświadczalną. Zaleca się wcześniejsze określenie ilości światła wymaganego dla konkretnych konstruktów, a także ustawień autofokusu dla innych mikroskopów time-lapse lub bakterii przed przystąpieniem do właściwego eksperymentu. Krótsze czasy ekspozycji i mniejsza ilość światła wzbudzenia zminimalizują efekt blaknięcia oraz fototoksyczność. Do procedury autofokusu użyj światła diaskopowego.

W eksperymentach z mikroskopii time-lapse opublikowanych w pracy de Jong et al. 2010 ⁵ zastosowano następujące ustawienia: klatki do filmów rejestrowano w odstępach 8 lub 12 minut, używając 10 % białego światła LED APLLC i czasu ekspozycji 0,05 s dla obrazów w jasnym polu, 10% światła ksenonowego i czasu ekspozycji 0,5 s dla detekcji GFP oraz 32% światła ksenonowego i czasu ekspozycji 0,8 s dla detekcji mCherry. Surowe dane zapisywano przy użyciu oprogramowania softWoRx 3.6.0 (Applied Presicion). Autofokus zaprogramowano na kroki o wielkości 0,06 μm i całkowity zakres 1,2 μm.

4. Umieść przygotowany preparat (sekcja 2) w uprzednio ogrzanej komorze środowiskowej mikroskopu i monitoruj wzrost pojedynczych komórek w monowarstwę mikrokolonii w temperaturze 30°C.

Wskazówki szczegółowe:

• Wybierz pojedyncze komórki znajdujące się w środkowej części podkładki agarowej. Krawędzie podkładki agarowej wysychają szybciej. Zapisz pozycję X,Y,Z za pomocą oprogramowania mikroskopu.
• Duże przemieszczenia stolika w kierunkach X,Y i Z mogą zaburzyć strukturę agarozy, a w konsekwencji utrudnić identyfikację komórek przez procedurę autofokusu. W celu zminimalizowania ruchów w osiach X,Y,Z, zazwyczaj nie wybieramy więcej niż 10 pozycji na jeden eksperyment, nawet jeśli preparat zawiera wiele szczepów.
• Po wybraniu pierwszej komórki reguluj ostrość w osi Z wyłącznie za pomocą oprogramowania. Od tego momentu nie zmieniaj ostrości ręcznie za pomocą pokrętła „Z” na korpusie mikroskopu, chyba że jest ono kodowane cyfrowo. Upewnij się, że po każdej procedurze autofokusu nowa pozycja X,Y,Z została zapisana przez oprogramowanie.
• Przed rozpoczęciem pomiaru sprawdź, czy ustawienia autofokusu są odpowiednie dla danego eksperymentu. Zastosowanie mikroskopii kontrastowej może poprawić działanie procedury autofokusu w porównaniu z mikroskopią w jasnym polu lub DIC dzięki zwiększonemu kontrastowi. Jednak pierścień fazowy w obiektywach do kontrastu fazowego sprawia, że są one mniej czułe (o około 10%) przy zbieraniu światła fluorescencyjnego. Dlatego w przypadku próbek o słabej fluorescencji lepiej zastosować obiektyw bez pierścienia fazowego.
• Przez pierwsze pół godziny, aż do momentu stabilizacji przebiegu eksperymentu, sprawdzaj co pół godziny, czy wybrane komórki nadal pozostają w ostrości. Jeśli w tym momencie komórki znajdą się poza ogniskową, skoryguj ostrość ręcznie. Może to być konieczne w pierwszych godzinach z powodu wahań temperatury oraz niedostatecznego wysuszenia próbek. Ponadto, dzięki zwiększonemu kontrastowi, autofokus działa lepiej, gdy w polu widzenia znajduje się więcej komórek.

5. Po zakończeniu eksperymentu rozdziel poszczególne kanały filmu i zapisz je jako osobne pliki (np. kontrast fazowy, GFP, mCherry), jeśli jest to wymagane (niektóre pakiety akwizycyjne zapisują wszystkie kanały w jednym pliku stosowym). Na potrzeby publikacji obrazy można ulepszyć za pomocą dekonwolucji 2D, co jest szczególnie przydatne w badaniach lokalizacji białek. Wykonaj dekonwolucję obrazów, korzystając z oprogramowania mikroskopu lub komercyjnego pakietu, takiego jak Huygens (www.svi.nl).
6. Przeanalizuj dane przy użyciu programu ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) (w tym celu użyj surowych, nieprzetworzonych plików obrazów) oraz programu Microsoft Excel lub Sigma Plot. Stosy obrazów można na przykład zapisać w ImageJ jako plik wideo ".avi". Szczegółowy opis pomiaru fluorescencji pojedynczych komórek w czasie znajduje się poniżej.

4. Analiza danych dynamiki aktywności promotora przy użyciu programu ImageJ

Zauważamy, że dostępne są inne wysokiej jakości pakiety oprogramowania specjalizujące się w analizie obrazów z mikroskopii poklatkowej, takie jak oprogramowanie BHV ^{9, 4}, Schnitzcell ¹⁰, PSICIC ¹¹ oraz Microbe-Tracker ¹², jednak w niniejszym opracowaniu skupiamy się na bezpłatnie dostępnym pakiecie ImageJ.

1. Pobierz program ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) oraz (jeśli to konieczne) odpowiednią wtyczkę do otwierania plików (stosem klatek). Na przykład filmy zarejestrowane przy użyciu mikroskopu deltavision można otworzyć w ImageJ jedynie za pomocą wtyczki deltavision opener. Skopiuj wtyczkę DV do folderu wtyczek ImageJ i uruchom program. Zmień pojemność pamięci w menu edit/option/memory&threads na 1250. Pozwala to na pracę z większymi plikami, takimi jak filmy time-lapse.
2. Aby ocenić historię pojedynczej komórki, otwórz oryginalny film w kontraście fazowym jednej mikrokolonii i przewiń do ostatniej interesującej klatki filmu. Wybierz przycisk zaznaczania „segmented lines” w menu.
3. Narysuj linię w tle i naciśnij „CTRL” + „T”. Otworzy to menedżera obszarów zainteresowania (ROI manager). (Odpowiadająca wartość fluorescencji tła może zostać użyta do ręcznego odjęcia tła – patrz poniżej. Alternatywnie można skorzystać z procedury odejmowania tła dostępnej w programie ImageJ). Narysuj również linię w interesującej komórce i dodaj ROI do menedżera ROI. Ponieważ w tym studium przypadku badamy fuzje promotor-GFP, a GFP jest rozproszone w całej cytoplazmie, cała komórka powinna mieć podobne wartości fluorescencji dla każdego pojedynczego piksela na całej jej długości. Cofnij się o jedną klatkę w czasie i wybierz nowe ROI w tej samej interesującej komórce. Zapisz to trzecie ROI i kontynuuj procedurę, aż zapisane zostanie odpowiednie ROI w pierwszej klatce filmu.
   Należy pamiętać, że fluorescencja komórek potomnych może znacznie różnić się po podziale komórki. Można zastosować barwnik błonowy, który można podać wraz z białkami fluorescencyjnymi produkowanymi przez komórki (np. kombinację czerwonego barwnika błonowego FM^® 5-95 (Invitrogen) i GFP), aby zwizualizować tworzenie się przegrody. W takim przypadku do śledzenia komórek w czasie należy użyć odpowiedniego kanału fluorescencji, a nie filmu w kontraście fazowym. Alternatywnie, aby zachować ostrożność, można wybierać ROI tylko w jednej połowie komórki.
4. W menedżerze ROI kliknij „save”. Jeśli rozszerzenie pliku to „.roi”, zostanie wybrany i zapisany tylko jeden obszar z listy. Jeśli rozszerzenie pliku to „.zip”, zostanie zapisany cały zestaw (wymagane).
5. Zamknij film w kontraście fazowym i otwórz oryginalny film fluorescencyjny (np. GFP). Kliknij „show all” i „measure” w menedżerze ROI. Otworzy się nowe okno (Results). Skopiuj wyniki do arkusza Excel i odjąć średnią fluorescencję każdej pojedynczej komórki od fluorescencji tła medium. Wynikową fluorescencję netto można przedstawić na wykresie w funkcji czasu, aby ukazać aktywność promotora interesującej komórki w czasie.
6. Alternatywnie można przeanalizować fluorescencję wszystkich komórek mikrokolonii w konkretnym punkcie czasowym. Aby to zrobić, wybierz i zapisz ROI dla tła oraz każdej pojedynczej komórki w jednej klatce, jak opisano powyżej, skopiuj wartości fluorescencji do programu Excel i stwórz histogramy za pomocą funkcji „histogram” w menu „tool”.
7. Aby uzyskać obrazy z pojedynczych klatek do publikacji, wybierz interesującą klatkę, wybierz „image” - „duplicate image” i zmień typ obrazu na „RGB” lub „8-bit”, wybierając „image” - „type” - „RGB color” lub „8-bit”. Zapisz zduplikowaną klatkę jako plik „.tiff”. Obrazy RGB/8-bit można otwierać w konwencjonalnych programach graficznych, takich jak CorelDraw lub Adobe Illustrator. W razie potrzeby obrazy można dostosować za pomocą funkcji „image” - „adjust” - „brightness/contrast” lub „image” - „adjust” - „window/level” w programie ImageJ.

5. Tworzenie filmów do publikacji za pomocą ImageJ

1. Otwórz oryginalny film w kontraście fazowym oraz odpowiadające mu filmy fluorescencyjne w programie ImageJ zgodnie z powyższym opisem. Wybierz przycisk zaznaczeń prostokątnych (1^ny od lewej) i narysuj prostokątny ROI na pierwszej klatce w taki sposób, aby rozwijająca się mikrokolonia znajdowała się wewnątrz ROI przez cały czas trwania filmu. Wybierz "image" - "crop" i zapisz tę mniejszą wersję filmu pod nową nazwą. Wybierz ten sam ROI za pomocą menedżera ROI w filmie fluorescencyjnym i postąp analogicznie.
2. Aby połączyć filmy poziomo lub pionowo, wybierz "plugin" - "stack combiner". W razie potrzeby można dodać znacznik czasu poprzez "plugin" - "time stamper". Zapisz połączony stos raz jako plik ".dv" lub ".tiff", a raz jako film ".avi" lub QuickTime.

Alternatywne adaptacje protokołu dla Streptococcus pneumoniae (Rysunek 4 i Film 2):

6. Przygotowanie kultur S. pneumoniae

1. Hodować komórki S. pneumoniae (szczep kapsułowany D39 ¹³ lub niekapsułowany R6 ¹⁴) w formie kultur stojących w podłożu C+Y ¹⁵ w temperaturze 37°C do osiągnięcia gęstości optycznej OD przy A_600nm wynoszącej około 0,4. Odwirować komórki przez 2 min przy 14000 rpm i resuspendować osad komórkowy w objętości świeżego podłoża C+Y zawierającego 14,5% glicerolu (v/v), tak aby uzyskać A_600nm dokładnie równą 0,4. Rozdzielić komórki na alikwoty i przechowywać w temperaturze -80°C do późniejszego użycia.
2. Do mikroskopii time-lapse pobrać alikwot wcześniej hodowanych komórek S. pneumoniae. Zaszczepić 4 ml świeżego podłoża C+Y w stosunku 1:100 komórkami z alikwoty przechowywanej w -80°C. Hodować komórki do połowy fazy logarytmicznej, aż do osiągnięcia OD A_600nm na poziomie 0,1 - 0,2. Zazwyczaj trwa to około 2 godzin w przypadku użycia komórek z alikwotów -80°C.

7. Przygotowanie próbki do badania mikroskopowego

1. Przygotować preparat mikroskopowy zgodnie z powyższym opisem dla B. subtilis należy upewnić się, że agar zawiera złożone podłoże C+Y. Ponieważ S. pneumoniae jest mikroaerofilem, więc pęcherzyki powietrza między paskami agarozy powinny być mniejsze niż w przypadku B. subtilis (~1 mm odstępu po obu stronach).
2. Zmierz absorbancję hodowli przy 600 nm (A₆₀₀), rozcieńczyć komórki S. pneumoniae w fazie wzrostu wykładniczego do przybliżonej wartości A₆₀₀ o wartości 0,05 przy użyciu pożywki C+Y i wykorzystaj to rozcieńczenie do nałożenia na szkiełko z agarozą.

8. Mikroskopia fazokontrastowa z rejestracją poklatkową

Dostosuj ustawienia mikroskopu dla S. pneumoniae: zastosuj mikroskopię fazowo-kontrastową, ponieważ S. pneumoniae jest trudny do zidentyfikowania przy użyciu mikroskopii w polu jasnym. Kontynuuj protokół zgodnie z opisem dla B. subtilis (wykonaj kroki 2.9 - 3.7). Komórki S. pneumoniae można hodować w temperaturze 30°C lub 37°C (rosną szybciej w 37°C).

9. Reprezentatywne wyniki:

Eksperyment fluorescencyjny typu time-lapse uznaje się za przeprowadzony pomyślnie, jeśli bakterie wyrosły w monowarstwę mikrokolonii, która w momencie zakończenia eksperymentu znajduje się w całości w polu widzenia (patrz Rysunek 5A-C). Jeśli komórki narosły na siebie, nie tylko niemożliwe jest dokładne odtworzenie ich historii, ale poziomy fluorescencji nakładających się komórek nie mogą być prawidłowo zmierzone. Komórki mają tendencję do narastania na siebie, jeśli naniesione komórki nie zostały wystarczająco wysuszone (krok 2.9) lub jeśli skład pożywki wymaga dostosowania w celu uzyskania wolniejszego wzrostu. Jeśli mikrokolonia wyrosła poza pole widzenia, nie można określić rozkładu sygnałów fluorescencji w obrębie jednej kolonii. Przyczynami „przemieszczania się mikrokolonii” mogą być niewystarczające wysuszenie naniesionych komórek (krok 2.9) lub brak zaprogramowania oprogramowania do śledzenia mikrokolonii podczas jej rozwoju. Ponadto istotne jest, aby w pożywce nie występowały lokalne obszary zwiększonej fluorescencji, ponieważ przesłaniają one sygnały fluorescencyjne pochodzące z komórek (patrz Rysunek 5D-F). Problemy związane z tłem mogą wynikać ze składników pożywek, pęcherzyków powietrza lub nierozpuszczonych grudek agarozy. Aby to zobrazować, na Rys. 5F przedstawiono sygnały tła dla tego konkretnego preparatu, gdy obraz był rejestrowany przy użyciu filtrów wzbudzenia/emisji dla czerwonych barwników fluorescencyjnych. Jak widać, występują jasne punkty autofluorescencyjne, które mogłyby utrudnić obrazowanie. Aby zapobiec powstawaniu takich punktów, należy upewnić się, że agaroza jest całkowicie rozpuszczona i że podczas nakładania szkiełka nakrywkowego na szkiełko mikroskopowe nie powstały pęcherzyki powietrza.

Rycina 1: Przegląd eksperymentu

Rycina 2: Przygotowanie próbki do badania mikroskopowego

Rysunek 3: Mikroskopia fluorescencyjna time-lapse komórek B. subtilis zawierających fuzję P_kinB-gfp. Migawki pochodzą z Filmu 1. Panele górne: pole jasne, panele dolne: kanał GFP.

Rycina 4: Mikroskopia fazowo-kontrastowa w trybie time-lapse szczepu dzikiego R6 S. pneumoniae. Migawki pochodzą z Filmu 2.

Rycina 5: Ilustracja możliwych wyników mikroskopii (time-lapse). A-C przedstawiają czynniki, które należy wziąć pod uwagę w przypadku danych uzyskanych przy ustawieniach oświetlenia diaskopowego. (A) Mikrograf w jasnym polu monolayeru mikrokolonii (wynik pozytywny) sporulujących komórek B. subtilis (B) Obraz w jasnym polu mikrokolonii B. subtilis, w której niektóre komórki narosły na siebie (wynik negatywny) (C) Obraz w jasnym polu sporulującej mikrokolonii B. subtilis, która wyrosła poza płaszczyznę ostrości (wynik negatywny). D-F przedstawiają czynniki, które należy wziąć pod uwagę w przypadku danych uzyskanych przy ustawieniach oświetlenia episkopowego (D) Obraz w kontraście fazowym komórek B. subtilis w fazie wykładniczej, przedstawiony w celu wizualizacji źródła sygnałów fluorescencyjnych w E i F (E) Sygnały GFP komórek pokazanych w D. Należy zauważyć, że sygnały tła są podobne w każdym pikselu (wynik pozytywny). Należy również zwrócić uwagę, że czas ekspozycji może być zbyt długi, ponieważ jedna komórka wykazuje sygnał nasycony (wynik negatywny) (F) Sygnały uzyskane przez kanał czerwony dla komórek pokazanych w D. Należy zauważyć, że tło zawiera obszary o zwiększonym poziomie czerwonej fluorescencji (wynik negatywny).

Film 1. Mikroskopia fluorescencyjna time-lapse komórek B. subtilis zawierających fuzję P_kinB-gfp. Zdjęcia wykonywano w odstępach 8 min. Po lewej: pole jasne, po prawej: kanał GFP. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Film 2. Mikroskopia fazowo-kontrastowa w czasie (time-lapse) szczepu dzikiego S. pneumoniae R6. Zdjęcia wykonywano w odstępach 10 min. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Dyskusja

W przeciwieństwie do wielu innych technik analizy pojedynczych komórek, opisana tutaj metoda mikroskopii fluorescencyjnej time-lapse może być wykorzystana do śledzenia historii konkretnej komórki w odniesieniu do jej przodków, zachowania oraz zdarzeń podziału. W połączeniu z fluorescencyjnie znakowanymi promotorami docelowymi lub białkami, można w czasie rzeczywistym śledzić aktywację specyficznych szlaków rozwojowych, a także monitorować lokalizację i dynamikę białek podczas rozwoju bakterii.

Jak wskazano powyżej, badania koncentrujące się na różnych gatunkach bakterii można przeprowadzić poprzez dostosowanie warunków hodowli do wymagań konkretnej bakterii. Jedynymi napotkanymi przez nas ograniczeniami były warunki wzrostu oraz wielkość próbki. Ze względu na szczelne środowisko, warunków pożywki nie można zmieniać w trakcie eksperymentu. Ponadto, w ramach jednego doświadczenia można efektywnie monitorować maksymalnie cztery szczepy.

Biorąc pod uwagę kilka krytycznych etapów, opisana tutaj metoda analizy pojedynczych komórek może zostać z łatwością zastosowana przy użyciu dowolnego mikroskopu automatycznego. Poniżej przedstawiono przegląd tych krytycznych etapów. Szczegółowe informacje znajdują się w tekście głównym. Przygotowanie ogólne: Zaleca się sprawdzenie ustawień autofokusu wymaganych dla konkretnej bakterii przed rozpoczęciem eksperymentu. Podobnie, jeśli to możliwe, należy wcześniej określić przybliżone optymalne ustawienia dla wizualizacji fluorescencji. Ponadto przestrzeganie przygotowanego harmonogramu pomaga w odpowiednim przygotowaniu wszystkich materiałów (podgrzanie komory mikroskopu, zaprogramowanie ustawień mikroskopu, przygotowanie szkiełka na godzinę przed osiągnięciem przez komórki pożądanej fazy wzrostu, patrz Ryc. 1). Wzrost B. subtilis w TLM i CDM: TLM i CDM są chemicznie zdefiniowanymi mediami głodzeniowymi, w których B. subtilis rośnie powoli. Czas hodowli komórek w tych mediach może wymagać przedłużenia w zależności od konkretnego szczepu. Wolny wzrost zapobiega nakładaniu się komórek na siebie. Przygotowanie próbki do mikroskopu: Należy zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza między ramką genu, szkiełkiem przedmiotowym a szkiełkiem nakrywką, aby uniknąć nadmiernego wysychania medium na bazie agarozy. To samo dotyczy styku medium ze szkiełkiem nakrywką. Kluczowe jest dopuszczenie do wystarczającego wyschnięcia komórek, aby zapobiec ich przemieszczaniu się i/lub wzrostowi wielowarstwowemu. Mikroskopia fluorescencyjna time-lapse: Podgrzanie szkiełka oraz komory środowiskowej jest kluczowe dla uniknięcia poważnych problemów z autofokusem. Komórki należy wybierać w środku podkładki agarowej, ponieważ mają one największą szansę pozostać w polu widzenia i w ostrości podczas eksperymentu (pod warunkiem, że próbka została wystarczająco wysuszona). Maksymalna liczba 10 lokalizacji na eksperyment wciąż pozwala na prawidłowe działanie. Po wybraniu pierwszej interesującej komórki należy używać oprogramowania wyłącznie do regulacji ostrości (szczegóły w tekście). W ciągu pierwszych godzin eksperymentu należy w odstępach 30 min sprawdzać, czy komórki nadal znajdują się w ostrości. Analiza: Przed przystąpieniem do rozszerzonych procedur analitycznych ważne jest sprawdzenie, czy tło medium ma podobne wartości w kanałach fluorescencji. Małe cząsteczki kurzu, składniki medium, zabrudzone soczewki lub maleńkie grudki agarozy mogą przyczyniać się do lokalnego zwiększenia fluorescencji, co utrudnia lub uniemożliwia analizę filmu. Rozwiązywanie problemów: Jeśli komórki rosną jedna na drugiej, może to wskazywać na zbyt wczesne nałożenie szkiełka nakrywki lub na to, że medium nie nadaje się do wzrostu monowarstw mikrokolonii. Jeśli interesujące komórki stale obumierają przedwcześnie, podczas gdy inne komórki na szkiełku dzielą się prawidłowo, należy sprawdzić, czy filtr UV został ustawiony w odpowiedniej pozycji. Podczas długich eksperymentów pomocne może być również skrócenie czasu ekspozycji lub zmniejszenie natężenia światła.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ramka odczytu genu	ABgene Limited	AB-0578	1,7 x 2,8 cm
agaroza niskotopliwa o wysokiej rozdzielczości	Sigma-Aldrich	A4718
duże szkiełko nakrywkowe	Wielu dostawców		24 x 50 mm
opcjonalnie barwnik błonowy, np. FM 5-95	Invitrogen	T23360	dostępne są również inne barwniki membranowe: **Sonda TaqMan Gene Expression Assay** **Przegląd** Sondy TaqMan Gene Expression Assay umożliwiają precyzyjną i czułą analizę ilościową ekspresji genów w próbkach RNA za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR). Każdy zestaw zawiera specyficzną parę starterów oraz sondę fluorescencyjną, które zostały zoptymalizowane pod kątem wydajności i specyficzności w celu zapewnienia dokładnego pomiaru poziomu mRNA konkretnego genu. **Zasada działania** Sondy TaqMan wykorzystują mechanizm transferu energii w rezonansie (FRET). Sonda składa się z oligonukleotydu z przyłączonym do jednego końca fluoroforem (reporterem), a do drugiego wygaszaczem (quencherem). Dopóki sonda pozostaje nienaruszona, wygaszacz hamuje sygnał fluorescencyjny reportera. Podczas fazy wydłużania PCR, polimeraza DNA z aktywnością egzonukleazy 5' $\rightarrow$ 3' degraduje sondę, co powoduje oddzielenie reportera od wygaszacza i emisję sygnału fluorescencyjnego proporcjonalnego do ilości syntetyzowanego produktu PCR. **Zalety** * **Wysoka specyficzność:** Zastosowanie zarówno starterów, jak i sondy, zapewnia podwójną weryfikację sekwencji docelowej. * **Kwantyfikacja w czasie rzeczywistym:** Pozwala na monitorowanie amplifikacji w każdym cyklu. * **Zoptymalizowane parametry:** Każdy assay jest testowany pod kątem wydajności i specyficzności. * **Kompatybilność:** Możliwość pracy z wieloma systemami qPCR i różnymi barwnikami fluorescencyjnymi. **Zalecany protokół** **1. Przygotowanie cDNA** Przed przeprowadzeniem qPCR należy przekształcić wyizolowane RNA w cDNA za pomocą odwrotnej transkrypcji (RT). Zaleca się stosanie wysokiej jakości zestawów do syntezy cDNA, aby zapewnić reprezentatywność próbki. **2. Warunki reakcji qPCR** Sondy TaqMan Gene Expression Assay są zoptymalizowane do pracy z standardowymi mieszankami Master Mix do qPCR zawierającymi polimerazę DNA i dNTP. Typowy program termiczny: * **Denaturacja wstępna:** 95°C przez 2–10 minut. * **Cykle (40 cykli):** * Denaturacja: 95°C przez 15 sekund. * Przyłączanie i wydłużanie: 60°C przez 1 minutę. **3. Analiza danych** Po zakończeniu reakcji qPCR należy przeanalizować krzywe amplifikacji i wyznaczyć wartość Ct (cykl progowy). Do względnej kwantyfikacji ekspresji genów zaleca się metodę $\Delta\Delta$Ct z wykorzystaniem genu referencyjnego (tzw. genu housekeeping), aby znormalizować ilość cDNA w każdej próbce. **Przechowywanie i stabilność** Przechowywać w temperaturze -20°C. Unikać częstych cykli zamrażania i rozmrażania poprzez przygotowanie aliquotów. **Uwagi** * Zawsze stosuj odpowiednie środki ostrożności przy pracy z materiałami biologicznymi. * Przechowuj wszystkie odczynniki w temperaturze 4°C podczas przygotowywania reakcji.
Mikroskop do obrazowania poklatkowego z komorą inkubacyjną	Wielu dostawców		szczegółowe informacje na temat naszego urządzenia znajdują się w odpowiednich sekcjach