Obrazowanie żywych komórek Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae przy użyciu zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej

Summary

Ten protokół zapewnia krok po kroku procedurę monitorowania zachowania pojedynczych komórek różnych bakterii w czasie za pomocą automatycznej fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej. Ponadto udostępniamy wytyczne dotyczące analizy obrazów mikroskopowych.

Abstract

W ciągu ostatnich kilku lat naukowcy coraz bardziej zdawali sobie sprawę, że przeciętne dane uzyskane z eksperymentów opartych na populacji mikrobiologicznej nie są reprezentatywne dla zachowania, statusu czy fenotypu pojedynczych komórek. Ze względu na to nowe spostrzeżenie, liczba badań nad pojedynczymi komórkami stale rośnie (ostatnie przeglądy patrz ^1,2,3). Jednak wiele stosowanych technik pojedynczych komórek nie pozwala na monitorowanie rozwoju i zachowania jednej konkretnej pojedynczej komórki w czasie (np. cytometria przepływowa lub standardowa mikroskopia).

Tutaj podajemy szczegółowy opis metody mikroskopowej używanej w kilku ostatnich badaniach ^{4, 5, 6, 7}, która pozwala śledzić i rejestrować (fluorescencję) pojedynczych komórek bakteryjnych Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae poprzez wzrost i podział przez wiele pokoleń. Powstałe w ten sposób filmy można wykorzystać do skonstruowania filogenetycznych drzew rodowodu, śledząc historię pojedynczej komórki w populacji, która wywodzi się od jednego wspólnego przodka. Ta metoda poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej może być stosowana nie tylko do badania wzrostu, podziału i różnicowania poszczególnych komórek, ale także do analizy wpływu historii komórki i pochodzenia na określone zachowanie komórki. Co więcej, mikroskopia poklatkowa idealnie nadaje się do badania dynamiki ekspresji genów i lokalizacji białek podczas cyklu komórkowego bakterii. Metoda wyjaśnia, w jaki sposób przygotować komórki bakteryjne i skonstruować szkiełko mikroskopowe, aby umożliwić wzrost pojedynczych komórek w mikrokolonię. Krótko mówiąc, pojedyncze komórki są dostrzegane na półstałej powierzchni składającej się z pożywki wzrostowej uzupełnionej agarozą, na której rosną i dzielą się pod mikroskopem fluorescencyjnym w komorze środowiskowej o kontrolowanej temperaturze. Obrazy są rejestrowane w określonych odstępach czasu, a następnie analizowane za pomocą oprogramowania open source ImageJ.

Protocol

1. Przygotowanie kultur B. subtilis

1. Zaszczepić komórki z zapasów o temperaturze -80°C w 10 ml pożywki do mikroskopii poklatkowej (TLM) (62 mM K₂HPO₄ , 44 mM KH₂PO₄, 15 mM (NH₄)₂SO₄, 6,5 mM cytrynian sodu, 0,8 mM_MgSO4, 0,02% casaminokwasów, 27,8 mM glukozy, 0,1 mM L-tryptofan, pH ustawiono na 7 przy użyciu roztworu KOH) uzupełnionego antybiotykami, w razie potrzeby.
2. Hoduj komórki przez noc w kolbie wstrząsającej (30°C, 225 obr./min).
3. Następnego ranka rozcieńczyć komórki w stosunku 1:10 we wstępnie podgrzanym chemicznie zdefiniowanym podłożu (CDM) (62 mM K₂HPO₄, 44 mM KH₂PO₄, 15 mM (NH₄)₂SO₄, 6,5 mM cytrynian sodu, 0,8 mM_MgSO4, 2,2 mM glukozy, 2,1 mM Kwas L-glutaminowy, 6 μM L-tryptofan, 7,5 μM MnCl₂, 0,15 x mieszanina metali (przygotować 50 x MT mieszanki bulionu (nr ⁸), który zawiera: 0,2 M MgCl₂, 70 mM CaCl₂, 5 mM MnCI₂, 0,1 mM ZnCl₂, 0,2 mM chlorowodorek tiaminy, 2 mM HCl, 0,5 mM FeCl₃ (dodać na końcu)) bez antybiotyków.
4. Wyhoduj komórki B. subtilis do środkowej fazy wykładniczej (30°C, 225 obr./min). Zwykle zajmuje to około czterech godzin. Co ważne, należy przygotować szkiełko agarozowe na godzinę przed osiągnięciem przez komórki środkowej fazy wykładniczej (patrz punkt 2).
5. Zmierzyć absorbancję kultury przy 600 nm (A₆₀₀) i rozcieńczyć komórki do przybliżonej wartości A₆₀₀ 0,035 za pomocą CDM. Ta średnica zewnętrzna zapewnia, że pojedyncze komórki z odpowiednimi odstępami są dostrzegane na szkiełku mikroskopowym do mikroskopii poklatkowej.

2. Przygotowanie próbki mikroskopowej (zobacz również Rysunek 2)

Na godzinę przed osiągnięciem przez komórki średniego wykładniczego wzrostu, przygotuj szkiełko mikroskopowe w następujący sposób:

1. Wyczyść dwa szkiełka mikroskopowe (np. Knittel Glass, 7,6 x 2,6 cm) 70% etanolem i wodą.
2. Weź ramkę genową (ABgene; 1,7 x 2,8 cm) i ostrożnie usuń jedną z folii z tworzywa sztucznego z ramki genu, nie powodując demontażu plastikowej osłony po drugiej stronie ramki genu.
3. Przymocuj ramkę genową na środku jednego ze szklanych szkiełek, ułatwiając najpierw kontakt tylko z jednej strony, a następnie prowadząc kontrolę nad pozostałą ramką genową za pomocą paznokcia. Zapobiegaj powstawaniu pęcherzyków powietrza podczas mocowania ramki genowej do szkiełka podstawowego.
4. Użyj kuchenki mikrofalowej, aby rozpuścić 150 mg (1,5%) niskotopliwej agarozy o wysokiej rozdzielczości (Sigma) w 10 ml CDM. Agaroza musi być całkowicie rozpuszczona, aby uzyskać minimalne tło wymagane do eksperymentów z mikroskopią poklatkową. W razie potrzeby należy w tym czasie uzupełnić agarozę-CDM o induktor lub inne związki
5. Przenieść 500 μl ciepłej agarozy-CDM w środek ramki genowej. Upewnij się, że cały obszar, w tym (granice), jest całkowicie pokryty.
   Następujące kroki (2.6 - 2.10) muszą być wykonane szybko, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu agarozy-CDM.
6. Umieść drugie szkiełko podstawowe na ramce genowej wypełnionej agarozą-CDM. Staraj się unikać pęcherzyków powietrza. Umieścić szkiełka warstwowe w pozycji poziomej na 45 minut w temperaturze 4°C w lodówce, aby agaroza-CDM wystarczająco zastygła.
7. Ostrożnie zsuń górną szklaną szkiełko. Za pomocą żyletki wyciąć paski agaru o szerokości ~5 mm w ramce genu, na których będą rosły komórki. Na prowadnicę można użyć maksymalnie trzech pasków, oddalonych od siebie o ~4 mm odstępu z każdej strony. Przestrzenie te dostarczą powietrze, które jest niezbędne do wzrostu B. subtilis. Jeśli w czasie trzeba podążać za czterema różnymi szczepami, można wykonać dwa paski i przeciąć je na pół, aby uzyskać cztery małe kwadraty. Usunąć wszelkie pozostałości ciała stałego.
8. Ostrożnie zdejmij drugą i ostatnią plastikową osłonę z ramki genu, aby odsłonić lepką stronę ramki genu
9. Załaduj pojedyncze ogniwa (z kroku 1.5) na stałe podłoże, nie dotykając go końcówką pipety. Użyj 2,5 μl na cały pasek lub 1 μl na mały kwadrat. Zawsze zaczynaj od wierzchu podkładki agarozowej i pozwól, aby płyn równomiernie rozproszył się na przypisanym mu obszarze wzrostu, obracając szkiełko w górę iw dół. Prowadnica jest gotowa, gdy tylko krawędzie cieczy ulegną pofałdowaniu, a ruch cieczy nie będzie już widoczny podczas obracania suwaka.
10. Umieść czyste szkiełko nakrywkowe mikroskopu (24 x 50 mm) na ramce genu z jednej strony na drugą (unikaj pęcherzyków powietrza). Upewnij się, że jest całkowicie zamocowany, naciskając paznokciem na szkiełko nakrywkowe wzdłuż ramki genowej. Jeśli szkiełko nakrywkowe zostanie umieszczone na komórkach, nie pozwalając im wyschnąć wystarczająco długo, komórki mają tendencję do wzrostu jedna na drugiej podczas eksperymentu. Należy również uważać, aby nie czekać zbyt długo z nałożeniem szkiełka nakrywkowego, ponieważ agaroza będzie wtedy zbyt sucha.
11. Podgrzewaj szkiełko przez 1 godzinę w temperaturze 30°C. Jeśli szkiełko zostanie umieszczone bezpośrednio w wstępnie ogrzanej komorze środowiskowej (patrz krok 3.1) mikroskopu, wahania temperatury mogą powodować problemy z autofokusem w pierwszych godzinach eksperymentu.

3. Poklatkowa mikroskopia fluorescencyjna (zobacz również Rysunek 3 i Film 1)

1. Wstępnie rozgrzej komorę środowiskową na czas (w naszych rękach co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu), aby zapobiec problemom z autofokusem po rozpoczęciu eksperymentu. Wymagany czas zależy od zastosowanej komory środowiskowej, a także systemu grzewczego i mikroskopu.
2. Wybierz odpowiedni obiektyw, filtry i lustro dichroiczne zgodnie z konfiguracją eksperymentalną. W przypadku długich eksperymentów upewnij się, że filtr UV jest umieszczony między źródłem światła a próbką. Ponadto, jeśli to możliwe, zablokuj część światła wzbudzenia za pomocą filtrów o neutralnej gęstości, aby zminimalizować ekspozycję.

Następujący sprzęt (dostarczony przez DeltaVision, UK) został użyty do eksperymentów z mikroskopią poklatkową opublikowanych w de Jong et al. ^{2010 5}: Mikroskop IX71 (Olympus), kamera CoolSNAP HQ2 (Princeton Instruments), ksenonowe źródło światła 300W, obiektyw 60x jasnego pola (1,25 NA), zestaw filtrów GFP (Chroma, wzbudzenie przy 470/40 nm, emisja 525/50 nm), zestaw filtrów mCherry (Chroma, wzbudzenie przy 572/35 nm, emisja 632/60 nm). Autofokus został wykonany przy użyciu światła diaskopowego i procedury autofokusa obecnej w oprogramowaniu Softworx firmy Deltavision. Należy zauważyć, że obecnie istnieje wiele innych systemów autofokusa, które również są odpowiednie, takich jak Zeiss Definite Focus, Nikon Perfect Focus System i Leica Adaptive Focus Control.

3. Zaprogramuj swój eksperyment zgodnie z konfiguracją eksperymentu. Rozsądnie jest określić ilość światła wymaganą dla określonych konstrukcji, a także ustawienia autofokusa dla innych mikroskopów poklatkowych lub bakterii przed właściwym eksperymentem. Krótsze czasy ekspozycji i mniejsza ilość światła wzbudzającego zminimalizują bielenie i fototoksyczność. Użyj światła diaskopowego do rutynowej procedury autofokusa.

Następujące ustawienia zostały użyte do eksperymentów z mikroskopią poklatkową opublikowanych w de Jong et al. ^{2010 5}: migawki do filmów były wykonywane w odstępach 8 lub 12 minut przy użyciu 10% białego światła LED APLLC i ekspozycji 0,05 s dla zdjęć w jasnym polu, 10% światła ksenonowego i ekspozycji 0,5 s dla wykrywania GFP oraz 32% światła ksenonowego i 0,8 s ekspozycji dla detekcji mCherry, odpowiednio. Surowe dane były przechowywane za pomocą softWoRx 3.6.0 (Applied Presicion). Autofokus został zaprogramowany na kroki 0,06 μm i całkowity zakres 1,2 μm.

4. Umieścić przygotowane szkiełko (sekcja 2) we wstępnie ogrzanej komorze środowiskowej mikroskopu i monitorować wzrost pojedynczych komórek w monowarstwę mikrokolonii w temperaturze 30°C.

Szczegółowe wskazówki:

• Wybierz pojedyncze komórki, które znajdują się w środku podkładki agarowej. Krawędzie podkładki agarowej łatwiej wysychają. Zapisz pozycję X,Y,Z za pomocą oprogramowania mikroskopu.
• Duże ruchy stolika w kierunku X, Y i Z mogą zaburzyć agarozę, a w konsekwencji utrudnić identyfikację komórek przez procedurę autofokusa. Ogólnie rzecz biorąc, aby zminimalizować ruch X,Y,Z, nie wybieramy więcej niż 10 pozycji na eksperyment, nawet jeśli slajd zawiera wiele szczepów.
• Po wybraniu pierwszej komórki dostosuj tylko ostrość Z za pomocą oprogramowania. Od tego momentu nie należy ręcznie zmieniać ostrości na korpusie mikroskopu za pomocą "pokrętła Z", chyba że jest to zakodowane cyfrowo. Upewnij się, że po każdej procedurze autofokusa nowa pozycja X, Y, Z jest zapisywana przez oprogramowanie.
• Przed rozpoczęciem eksperymentu sprawdź, czy ustawienia autofokusa są odpowiednie dla eksperymentu. Zastosowanie mikroskopii z kontrastem fazowym może poprawić procedurę autofokusa w porównaniu z użyciem mikroskopii jasnego pola lub mikroskopii DIC, ze względu na zwiększony kontrast. Jednak pierścień fazowy w obiektywach z kontrastem fazowym sprawia, że są one mniej wrażliwe (około 10%) na zbieranie światła fluorescencyjnego. Tak więc w przypadku próbek o słabej fluorescencji lepiej nadaje się obiektyw bez pierścienia fazowego.
• Sprawdzaj, czy wybrane komórki są nadal ostre co pół godziny, aż eksperyment będzie działał stabilnie. Gdy komórki w tym momencie są nieostre, dostosuj je ręcznie. Ze względu na wahania temperatury, a także słabo wysuszone próbki, może to być konieczne w pierwszych godzinach. Co więcej, ze względu na zwiększony kontrast, autofokus działa lepiej, gdy w polu widzenia znajduje się więcej komórek.

5. Po zakończeniu eksperymentu oddziel różne kanały filmu i zabezpiecz je jako osobne pliki (np. kontrast fazowy, GFP, mCherry), jeśli jest to wymagane (niektóre pakiety akwizycyjne umieszczają wszystkie kanały w jednym pliku stosowym). Na potrzeby publikacji zdjęcia można wzbogacić za pomocą dekonwolucji 2D, która jest szczególnie przydatna w badaniach lokalizacji białek. Zdekonwolucjonizuj obrazy za pomocą oprogramowania mikroskopu lub za pomocą komercyjnego pakietu, takiego jak Huygens (www.svi.nl).
6. Przeanalizuj dane za pomocą ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) (użyj do tego nieprzetworzonych, nieprzetworzonych plików graficznych) i Microsoft Excel lub Sigma Plot. Stosy można na przykład zapisać jako plik filmowy ".avi" w ImageJ. Szczegółowy opis tego, w jaki sposób można mierzyć fluorescencję pojedynczych komórek w czasie, znajduje się poniżej.

4. Analiza danych dynamiki aktywności promotora za pomocą ImageJ

Zauważamy, że dostępne są inne dobre pakiety oprogramowania, które specjalizują się w analizie obrazów z mikroskopii poklatkowej, takie jak oprogramowanie BHV ^{9, 4}, Schnitzcell ¹⁰, PSICIC ¹¹ i Microbe-Tracker ¹², ale tutaj skupiamy się na darmo dostępnym pakiecie ImageJ.

1. Pobierz ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) i (jeśli to konieczne) odpowiednią wtyczkę, aby otworzyć swój (ułożony) plik. Na przykład filmy nagrane za pomocą mikroskopu deltavision można otworzyć tylko w ImageJ za pomocą wtyczki deltavision opener. Skopiuj wtyczkę DV do folderu wtyczki ImageJ i uruchom program. Zmień pojemność pamięci w edit/option/memory&threads na 1250. Pozwala to na pracę z większymi plikami, takimi jak te uzyskane z filmów poklatkowych.
2. Aby ocenić historię pojedynczej komórki, otwórz oryginalny film z kontrastem fazowym jednej mikrokolonii i przewiń do ostatniej interesującej klatki w filmie. Wybierz przycisk wyboru "linie segmentowe" w menu.
3. Narysuj linię w tle i naciśnij "CTRL" + "T". Spowoduje to otwarcie menedżera regionów zainteresowania (ROI). (Odpowiednia wartość fluorescencji tła może być użyta do ręcznego odjęcia tła - patrz poniżej. Alternatywnie można użyć procedury odejmowania tła znajdującej się w programie ImageJ.) Narysuj również linię w interesującej Cię komórce i dodaj ROI do menedżera ROI. Ponieważ w tym studium przypadku badamy fuzje promotora-GFP, a GFP jest rozproszony w cytoplazmie, cała komórka powinna mieć podobne wartości fluorescencji dla każdego pojedynczego piksela na całej długości komórki. Przewiń o jedną klatkę do tyłu w czasie i wybierz nowy ROI w tej samej komórce, która Cię interesuje. Zapisz ten trzeci zwrot z inwestycji i kontynuuj procedurę, aż odpowiedni zwrot z inwestycji w pierwszej klatce filmu zostanie zapisany.
   Należy pamiętać, że fluorescencja komórek potomnych może się znacznie różnić po podziale komórki. Albo użyj barwnika błonowego, który można nakładać razem z białkami fluorescencyjnymi wytwarzanymi przez komórki (takimi jak połączenie czerwonego barwnika błonowego FM^® 5-95 (Invitrogen) i GFP), aby uwidocznić tworzenie się przegrody. W takim przypadku należy użyć odpowiedniego kanału fluorescencji, a nie filmu kontrastu fazowego, aby śledzić komórki w czasie. Alternatywnie można pozostać po bezpiecznej stronie, wybierając zwrot z inwestycji tylko w jednej połowie komórki.
4. W menedżerze ROI kliknij "zapisz". Jeśli zakończeniem pliku jest ".roi", to z listy wybierany jest jeden roi i tylko ten zostanie zapisany. Jeśli końcówką pliku jest ".zip", wtedy cały zestaw zostanie zapisany (wymagane).
5. Zamknij film z kontrastem fazowym i otwórz oryginalny film fluorescencyjny (np. GFP). Kliknij "pokaż wszystko" i "zmierz się" w menedżerze ROI. Otworzy się nowe okno (Wyniki). Skopiuj wyniki do arkusza Excela i odejmij średnią fluorescencję dla każdej pojedynczej komórki od fluorescencji tła pożywki. Uzyskaną fluorescencję netto można wykreślić w stosunku do czasu, aby ujawnić aktywność promotora interesującej komórki w czasie.
6. Alternatywnie, fluorescencja wszystkich komórek mikrokolonii może być analizowana w określonym punkcie czasowym. Aby to zrobić, wybierz i zapisz ROI dla tła i każdej pojedynczej komórki w jednej klatce, jak opisano powyżej, skopiuj wartości fluorescencji do Excela i utwórz histogramy za pomocą funkcji "histogram" w menu "narzędzie".
7. Aby uzyskać zdjęcia z pojedynczych ramek do publikacji, wybierz interesującą Cię ramkę, wybierz "obraz" - "zduplikuj obraz" i zmień typ obrazu na "RGB" lub "8-bitowy" wybierając "obraz" - "typ" - "kolor RGB" lub "8-bitowy". Zapisz zduplikowaną ramkę jako ".tiff". Obrazy RGB/8-bitowe można otwierać za pomocą konwencjonalnych programów do rysowania, takich jak CorelDraw lub Adobe Illustrator. W razie potrzeby zdjęcia można dostosować za pomocą "obraz" - "dostosuj" - "jasność/kontrast" lub "obraz" - "dostosuj" - "okno/poziom" w ImageJ.

5. Tworzenie filmów do publikacji za pomocą ImageJ

1. Otwórz oryginalny kontrast fazowy i odpowiadające mu filmy fluorescencyjne w ImageJ, jak opisano powyżej. Wybierz przycisk prostokątnych zaznaczeń (1^o. po lewej stronie) i narysuj prostokątny ROI w pierwszej klatce w taki sposób, aby rozwijająca się mikrokolonia była otoczona ROI przez cały film. Wybierz "obraz" - "przytnij" i zabezpiecz tę mniejszą wersję filmu pod nową nazwą. Wybierz ten sam ROI za pomocą menedżera ROI w filmie fluorescencyjnym i postępuj jak poprzednio.
2. Aby połączyć filmy w poziomie lub w pionie, wybierz "wtyczka" - "sumator stosów". W razie potrzeby znacznik czasu można dodać za pomocą "wtyczki" - "znacznik czasu". Połączony stos można zapisać raz jako ".dv" lub ".tiff" i raz jako ".avi" lub film quicktime.

Alternatywne adaptacje protokołu dla Streptococcus pneumoniae (Rysunek 4 i Film 2):

6. Przygotowanie kultur S. pneumoniae

1. Hoduj komórki S. pneumoniae (kapsułkowany szczep D39 ¹³ lub niekapsułkowany szczep R6 ¹⁴ jako stojące kultury w pożywce C + Y ¹⁵ w temperaturze 37 ° C, aż do osiągnięcia OD przy_{A 600 nm} około 0,4. Odwirować komórki przez 2 minuty przy 14000 obr./min i ponownie zawiesić osad komórkowy w objętości świeżej pożywki C + Y zawierającej 14,5% glicerolu (v / v), co dałoby A_{600 nm} dokładnie 0,4. Podziel ogniwa na porcje i przechowuj je w temperaturze -80°C do wykorzystania w przyszłości.
2. Do mikroskopii poklatkowej należy pobrać porcję wcześniej hodowanych komórek S. pneumoniae. Zaszczepić 4 ml świeżej pożywki C+Y w stosunku 1:100 komórkami o temperaturze -80°C. Hoduj komórki do połowy fazy wykładniczej do OD_{600 nm} 0,1 - 0,2. Zwykle zajmuje to około 2 godzin w przypadku stosowania ogniw o temperaturze -80°C.

7. Przygotowanie próbki mikroskopowej

1. Przygotować szkiełko mikroskopowe zgodnie z powyższym opisem dla B. subtilis, ale upewnić się, że agaroza zawiera złożoną pożywkę C+Y. Ponieważ S. pneumoniae jest mikroaerofilem, kieszenie powietrzne między paskami agarozy powinny być mniejsze niż w przypadku B. subtilis (~1 mm odstępu po obu stronach).
2. Zmierzyć absorbancję kultury przy 600 nm (A₆₀₀), rozcieńczyć wykładniczo rosnące komórki S. pneumoniae do przybliżonej pożywki A₆₀₀ 0,05 przy użyciu pożywki C + Y i użyć tego rozcieńczenia do obciążenia szkiełka agarozowego.

8. Mikroskopia poklatkowa z kontrastem fazowym

Dostosuj ustawienia mikroskopu dla S. pneumoniae: użyj mikroskopii z kontrastem fazowym, ponieważ S. pneumoniae jest trudny do zidentyfikowania za pomocą mikroskopii jasnego pola. Kontynuuj protokół zgodnie z opisem dla B. subtilis (wykonaj kroki 2.9 - 3.7). Komórki S. pneumoniae mogą być hodowane w temperaturze 30°C lub 37°C (rosną szybciej w temperaturze 37°C).

9. Reprezentatywne wyniki:

Eksperyment z fluorescencją poklatkową został przeprowadzony pomyślnie, jeśli bakterie wyrosły na monowarstwę mikrokolonii, która jest całkowicie zlokalizowana w polu widzenia na końcu eksperymentu (patrz Rysunek 5A-C). Jeśli komórki rosły jedna na drugiej, nie tylko niemożliwe jest dokładne prześledzenie ich historii, ale także nie można prawidłowo zmierzyć poziomów fluorescencji nakładających się komórek. Komórki mają tendencję do wzrostu jedna na drugiej, jeśli nakrapiane komórki nie zostały wystarczająco wysuszone (krok 2.9) lub jeśli skład pożywki musi zostać dostosowany, aby uzyskać wolniejszy wzrost. Jeśli mikrokolonia wyrosła poza zasięgiem wzroku, nie można określić rozkładu sygnałów fluorescencyjnych w obrębie jednej kolonii. Przyczyną "przemieszczania się mikrokolonii" może być niewystarczające wysuszenie wykrytych komórek (krok 2.9) lub to, jeśli oprogramowanie nie zostało zaprogramowane do śledzenia mikrokolonii podczas rozwoju. Ponadto ważne jest, aby miejscowe plamy o zwiększonej fluorescencji nie były wykrywalne w pożywce, ponieważ zasłania to sygnały fluorescencyjne pochodzące z komórek (patrz rysunek 5D-F). Problemy związane z tłem mogą wynikać ze związków pożywki, pęcherzyków powietrza lub nierozpuszczonych grudek agarozy. Aby to zobrazować, pokazujemy na rys. 5F sygnały tła tego konkretnego slajdu, gdy obraz został wykonany przy użyciu filtrów wzbudzenia/emisji dla czerwonych barwników fluorescencyjnych. Jak widać, obecne są jasne plamki autofluorescencyjne, które mogą utrudniać obrazowanie. Aby zapobiec takim plamom, upewnij się, że agaroza jest całkowicie rozpuszczona i nie ma pęcherzyków powietrza podczas umieszczania szkiełka nakrywkowego na szkiełku mikroskopowym.

Rysunek 1: Przegląd eksperymentu

Rysunek 2: Przygotowanie próbki mikroskopowej

Rysunek 3: Mikroskopia fluorescencyjna poklatkowa komórek B. subtilis zawierających fuzję P_kinB-gfp. Migawki pochodzą z filmu 1. Panele górne: jasne pole, panele dolne: kanał GFP.

Rysunek 4: Mikroskopia poklatkowa z kontrastem fazowym szczepu dzikiego S. pneumoniae szczepu R6. Migawki pochodzą z filmu 2.

Rysunek 5: Ilustracja możliwych (poklatkowych) wyników mikroskopii. A-C pokazuje czynniki, które należy wziąć pod uwagę w przypadku danych uzyskanych przy diaskopijnych ustawieniach światła. (A) Mikrografia w jasnym polu monowarstwy mikrokolonii (wynik pozytywny) zarodnikujących komórek B. subtilis (B) Obraz w jasnym polu mikrokolonii B. subtilis, w której niektóre komórki rosły jedna na drugiej (wynik negatywny) (C) Obraz w jasnym polu mikrokolonii zarodnikującej B. subtilis, która wyrosła poza pole ostrości (wynik negatywny). D-F pokazują czynniki, które należy wziąć pod uwagę w przypadku danych uzyskanych przy episkopowych ustawieniach światła (D) Obraz kontrastu fazowego komórek B. subtilis w fazie wykładniczej przedstawiony w celu wizualizacji, skąd pochodzą sygnały fluorescencyjne w E i F z (E) sygnałów GFP komórek pokazanych w D. Zauważ, że sygnały tła są podobne w każdym pikselu (wynik pozytywny). Należy również pamiętać, że czas ekspozycji może być zbyt długi, ponieważ jedna komórka pokazuje nasycony sygnał (wynik negatywny) (F) Sygnały uzyskane przez czerwony kanał komórek pokazanych w D. Zauważ, że tło zawiera obszary o zwiększonym poziomie czerwonej fluorescencji (wynik negatywny).

Film 1. Poklatkowa mikroskopia fluorescencyjna komórek B. subtilis zawierających fuzję P_kinB-gfp. Zdjęcia były wykonywane w odstępach 8-minutowych. Po lewej: jasne pole, po prawej: kanał GFP. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Film 2. Poklatkowa mikroskopia z kontrastem fazowym szczepu R6 typu dzikiego S. pneumoniae. Zdjęcia były wykonywane w odstępach 10-minutowych. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Discussion

W przeciwieństwie do wielu innych technik pojedynczych komórek, opisana tutaj metoda poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej może być używana do śledzenia historii określonej komórki w odniesieniu do jej przodków, zachowania i zdarzeń podziału. W połączeniu ze znakowanymi fluorescencyjnie docelowymi promotorami lub białkami, można śledzić w czasie aktywację specyficznego szlaku rozwojowego, a lokalizację białek i dynamikę białek można monitorować podczas rozwoju bakterii.

Jak wskazano powyżej, badania koncentrujące się na różnych gatunkach bakterii można przeprowadzić, dostosowując warunki wzrostu do wymagań dla określonej bakterii. Jedyne ograniczenia, jakie napotkaliśmy, są związane z warunkami wzrostu i wielkością próby. Ze względu na szczelne środowisko, warunki podłoża nie mogą zostać zmienione podczas eksperymentu. Co więcej, maksymalnie cztery szczepy w jednym eksperymencie mogą być skutecznie monitorowane.

Biorąc pod uwagę kilka krytycznych kroków, opisaną tutaj metodę analizy pojedynczych komórek można łatwo zastosować przy użyciu dowolnego mikroskopu automatycznego. Poniżej zostanie przedstawiony przegląd tych krytycznych kroków. Szczegółowe informacje znajdują się w tekście głównym. Przygotowanie ogólne: Przed eksperymentem dobrze jest sprawdzić ustawienia autofokusa wymagane dla konkretnej bakterii. Podobnie, jeśli to możliwe, należy wcześniej określić przybliżone optymalne ustawienia wizualizacji fluorescencji. Ponadto przestrzeganie przygotowanej linii czasowej pomaga w przygotowaniu całego materiału do użycia na czas (wstępne podgrzanie komory mikroskopu, zaprogramowanie ustawień mikroskopu, przygotowanie szkiełka na godzinę przed wejściem komórek w pożądaną fazę wzrostu, patrz rysunek 1). Wzrost B. subtilis w TLM i CDM: TLM i CDM to chemicznie zdefiniowane pożywki głodowe, w których B. subtilis rośnie powoli. Okres, w którym komórki są hodowane w pożywce, może wymagać wydłużenia w zależności od konkretnego szczepu. Powolny wzrost zapobiega gromadzeniu się komórek na sobie. Przygotowanie próbki mikroskopowej: Należy zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza między ramką genową, szkiełkiem podstawowym i szkiełkiem nakrywkowym, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu podłoża na bazie agarozy. To samo dotyczy interfejsu nośnika/szkiełka nakrywkowego. Bardzo ważne jest, aby komórki wyschły wystarczająco, aby zapobiec pływaniu i/lub wzrostowi wielu warstw. Poklatkowa mikroskopia fluorescencyjna: Wstępne rozgrzanie szkiełka oraz komory środowiskowej ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia poważnych problemów z autofokusem. Komórki powinny być wybierane w środku podkładki agarowej, ponieważ mają one największą szansę na pozostanie w terenie i skupienie się podczas eksperymentu (pod warunkiem, że próbka została wystarczająco dobrze wysuszona). Maksymalnie 10 lokalizacji w jednym eksperymencie nadal działa poprawnie. Po wybraniu pierwszej interesującej komórki użyj tylko oprogramowania, aby dostosować ostrość (szczegółowe informacje znajdują się w tekście). Sprawdź, czy komórki są nadal ostre w pierwszych godzinach eksperymentu w odstępach 30-minutowych. Analiza: Ważne jest, aby przed rozszerzonymi procedurami analizy sprawdzić, czy tło pożywki ma podobne wartości w kanałach fluorescencyjnych. Drobne cząsteczki kurzu, średnie komponenty, brudne soczewki lub drobne grudki agarozy mogą przyczyniać się do miejscowego zwiększenia fluorescencji, utrudniając lub uniemożliwiając analizę filmu. Rozwiązywanie problemów: Jeśli komórki rosną jedna na drugiej, może to oznaczać, że szkiełko nakrywkowe zostało przymocowane zbyt wcześnie lub że podłoże nie nadaje się do wzrostu monowarstw mikrokolonii. Jeśli interesujące komórki ciągle umierają przedwcześnie, podczas gdy inne komórki na szkiełku dzielą się szczęśliwie, możesz sprawdzić, czy umieściłeś filtr UV na swoim miejscu. Może to również pomóc w skróceniu czasu ekspozycji lub natężenia światła podczas długich eksperymentów.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gene Frame	ABgene Limited	AB-0578	1,7 x 2,8 cm
rozdzielczość niskotopliwa agaroza	Sigma-Aldrich	A4718
duże szkiełko nakrywkowe	Wielu dostawców		24 x 50 mm
w razie potrzeby, barwnik membranowy, np. FM 5-95	Invitrogen	T23360	Dostępne są również inne barwniki membranowe: http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf
Mikroskop poklatkowy z komorą środowiskową	Wielu dostawców		Zobacz szczegóły dotyczące naszego urządzenia w odpowiednich sekcjach