Obrazowanie żywych komórek Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej

Podsumowanie

Niniejszy protokół przedstawia szczegółową procedurę monitorowania zachowania pojedynczych komórek różnych bakterii w czasie, z wykorzystaniem zautomatyzowanej fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej. Ponadto przedstawiamy wytyczne dotyczące analizy uzyskanych obrazów mikroskopowych.

Streszczenie

W ciągu ostatnich kilku lat naukowcy coraz bardziej uświadamiają sobie, że średnie dane uzyskane z eksperymentów opartych na populacjach drobnoustrojów nie są reprezentatywne dla zachowania, stanu lub fenotypu pojedynczych komórek. W związku z tym nowym spostrzeżeniem liczba badań nad pojedynczymi komórkami stale rośnie (nowsze przeglądy literatury zob. ^1,2,3). Jednak wiele stosowanych technik analizy pojedynczych komórek nie pozwala na monitorowanie rozwoju i zachowania jednej, konkretnej komórki w czasie (np. cytometria przepływowa lub standardowa mikroskopia).

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy szczegółowy opis metody mikroskopowej wykorzystanej w kilku niedawnych badaniach ^{4, 5, 6, 7}, która umożliwia śledzenie i rejestrowanie (fluorescencji) pojedynczych komórek bakterii Bacillus subtilis oraz Streptococcus pneumoniae podczas wzrostu i podziałów przez wiele pokoleń. Powstające w ten sposób filmy mogą służyć do konstruowania drzew filogenetycznych poprzez odtwarzanie historii pojedynczej komórki w populacji wywodzącej się od jednego wspólnego przodka. Ta metoda mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse może być wykorzystana nie tylko do badania wzrostu, podziału i różnicowania pojedynczych komórek, ale także do analizy wpływu historii i pochodzenia komórki na określone zachowania komórkowe. Ponadto mikroskopia time-lapse idealnie nadaje się do badania dynamiki ekspresji genów oraz lokalizacji białek podczas cyklu komórkowego bakterii. Metoda ta wyjaśnia, jak przygotować komórki bakteryjne i przygotować szkiełko mikroskopowe, aby umożliwić rozwój pojedynczych komórek w mikrokolonię. W skrócie, pojedyncze komórki nanosi się na powierzchnię półstałą, składającą się z pożywki wzrostowej uzupełnionej agarozą, na której rosną i dzielą się pod mikroskopem fluorescencyjnym w komorze środowiskowej z kontrolą temperatury. Obrazy są rejestrowane w określonych odstępach czasu, a następnie analizowane przy użyciu oprogramowania o otwartym kodzie źródłowym ImageJ.

Protokół

1. Przygotowanie kultur B. subtilis

1. Zaszczepić komórki z zapasów przechowywanych w -80°C w 10 ml pożywki do mikroskopii poklatkowej (TLM) (62 mM K₂HPO₄ , 44mM KH₂PO₄, 15 mM (NH₄)₂SO₄, 6.5 mM cytrynianu sodu, 0.8 mM MgSO₄, 0.02 % kwasów kasamino, 27.8 mM glukozy, 0.1 mM L-tryptofanu, pH ustawione na 7 za pomocą roztworu KOH) uzupełnionej o antybiotyki, jeśli jest to konieczne.
2. Hodować komórki przez noc w kolbie z wytrząsaniem (30°C, 225 rpm).
3. Następnego ranka rozcieńczyć komórki w stosunku 1:10 w uprzednio ogrzanym chemicznie zdefiniowanym medium (CDM) (62 mM K₂HPO₄, 44mM KH₂PO₄, 15 mM (NH₄)₂SO₄, 6.5 mM cytrynianu sodu, 0.8 mM MgSO₄, 2.2mM glukozy, 2.1 mM kwasu L-glutaminowego, 6 μM L-tryptofanu, 7.5 μM MnCl₂, 0.15 x mieszaniny metali (przygotować 50x roztwór zapasowy mieszaniny MT (ref ⁸), który zawiera: 0.2 M MgCl₂, 70 mM CaCl₂, 5 mM MnCI₂, 0.1 mM ZnCl₂, 0.2 mM chlorowodorku tiaminy, 2 mM HCl, 0.5 mM FeCl₃ (dodać na końcu)) bez antybiotyków.
4. Hodować komórki B. subtilis do środkowej fazy wykładniczej (30°C, 225 rpm). Zazwyczaj trwa to około czterech godzin. Co istotne, przygotować szkiełko z agaroza na godzinę przed osiągnięciem przez komórki środkowej fazy wykładniczej (patrz sekcja 2).
5. Zmierzyć absorbancję kultury przy 600nm (A₆₀₀) i rozcieńczyć komórki do przybliżonej wartości A₆₀₀ wynoszącej 0.035 przy użyciu CDM. Taka gęstość optyczna (OD) zapewnia naniesienie pojedynczych komórek z odpowiednimi odstępami na szkiełko mikroskopowe do mikroskopii poklatkowej.

2. Przygotowanie próbki do badania mikroskopowego (patrz również Rycina 2)

Na godzinę przed osiągnięciem przez komórki fazy średniego wzrostu wykładniczego, przygotować szkiełko przedmiotowe w następujący sposób:

1. Oczyścić dwa szkiełka przedmiotowe (np. Knittel Glass, 7,6 x 2,6 cm) za pomocą 70% etanolu i wody.
2. Wziąć ramkę do genów (gene frame, ABgene; 1,7 x 2,8 cm) i ostrożnie usunąć jedną z plastikowych folii, uważając, aby nie doprowadzić do rozdzielenia plastikowej osłony po przeciwnej stronie ramki.
3. Przymocować ramkę do genów na środku jednego ze szkiełek, ułatwiając najpierw kontakt tylko z jednej strony, a następnie prowadząc mocowanie pozostałej części ramki za pomocą paznokcia. Należy zapobiegać powstawaniu pęcherzyków powietrza podczas przytwierdzania ramki do szkiełka.
4. Użyć kuchenki mikrofalowej, aby rozpuścić 150 mg (1,5%) wysokorozdzielczej agarozy niskotopliwej (Sigma) w 10 ml CDM. Agaroza musi zostać całkowicie rozpuszczona, aby uzyskać minimalne tło wymagane do eksperymentów z mikroskopią time-lapse. W razie potrzeby w tym momencie uzupełnić agarozę-CDM induktorem lub innymi związkami.
5. Przenieść 500 μl ciepłej agarozy-CDM na środek ramki do genów. Upewnić się, że cały obszar, w tym krawędzie, jest w pełni pokryty.
   Kolejne kroki (2.6 - 2.10) muszą zostać wykonane szybko, aby zapobiec nadmiernemu wysychaniu agarozy-CDM.
6. Położyć drugie szkiełko przedmiotowe na ramce do genów wypełnionej agarozą-CDM. Należy starać się unikać pęcherzyków powietrza. Umieścić tak przygotowaną kanapkę ze szkiełek w pozycji poziomej na 45 min w temperaturze 4°C w lodówce, aby pozwolić agarozie-CDM na wystarczające stwardnienie.
7. Ostrożnie zsunąć górne szkiełko przedmiotowe. Użyć żyletki, aby wyciąć wewnątrz ramki do genów paski agaru o szerokości ~5 mm, na których będą hodowane komórki. Na jednym szkiełku można wykorzystać maksymalnie trzy paski, oddzielone od siebie odstępami ~4 mm z każdej strony. Przestrzenie te zapewnią dopływ powietrza, który jest niezbędny do wzrostu B. subtilis. Jeśli należy monitorować w czasie cztery różne szczepy, można wykonać dwa paski i przeciąć je na pół, tworząc cztery małe kwadraty. Usunąć wszelkie pozostałości stałej pożywki.
8. Ostrożnie usunąć drugą i ostatnią plastikową osłonę z ramki do genów, aby odsłonić jej lepką stronę.
9. Nanieść pojedyncze komórki (z kroku 1.5) na stałą pożywkę, nie dotykając jej końcówką pipety. Użyć 2,5 μl na cały pasek lub 1 μl na mały kwadrat. Zawsze zaczynać od góry podkładki agarowej i pozwolić cieczy rozprowadzić się równomiernie na przypisanym obszarze wzrostu poprzez obracanie szkiełka góra-dół. Szkiełko jest gotowe, gdy brzegi cieczy staną się pofalowane, a ruch cieczy przestanie być widoczny podczas obracania szkiełka.
10. Położyć czyste szkiełko nakrywkowe (24 x 50 mm) na ramce do genów, przesuwając je od jednej strony do drugiej (unikając pęcherzyków powietrza). Zapewnić całkowite przyleganie, dociskając nakrywkę wzdłuż ramki do genów paznokciem. Jeśli nakrywkę zostanie położona na komórkach bez zapewnienia im odpowiedniego czasu na wyschnięcie, komórki mają tendencję do narastania na siebie podczas eksperymentu. Należy również uważać, aby nie czekać zbyt długo przed nałożeniem nakrywki, ponieważ agar stanie się wtedy zbyt suchy.
11. Podgrzać szkiełko wstępnie przez 1 h w temperaturze 30°C. Gdyby szkiełko zostało umieszczone bezpośrednio w wstępnie podgrzanej komorze środowiskowej (patrz krok 3.1) mikroskopu, wahania temperatury mogłyby spowodować problemy z autofokusem w pierwszych godzinach eksperymentu.

3. Mikroskopia fluorescencyjna time-lapse (patrz również Rysunek 3 i Film 1)

1. Podgrzej komorę inkubacyjną z odpowiednim wyprzedzeniem (w naszym przypadku co najmniej 2h przed rozpoczęciem eksperymentu), aby zapobiec problemom z autofokusem po uruchomieniu pomiarów. Wymagany czas zależy od zastosowanej komory inkubacyjnej, systemu grzewczego oraz mikroskopu.
2. Wybierz odpowiedni obiektyw, filtry i lustro dichroiczne zgodnie z konfiguracją eksperymentalną. W przypadku długotrwałych eksperymentów upewnij się, że między źródłem światła a próbką umieszczono filtr UV. Ponadto, jeśli to możliwe, ogranicz część światła wzbudzenia za pomocą filtrów neutralnych, aby zminimalizować ekspozycję.

W eksperymentach z mikroskopii poklatkowej opublikowanych przez de Jonga wykorzystano następujący sprzęt (dostarczony przez firmę DeltaVision, Wielka Brytania) i wsp. 2010 ⁵Mikroskop IX71 (Olympus), kamera CoolSNAP HQ2 (Princeton Instruments), ksenonowe źródło światła o mocy 300 W, obiektyw w świetle jasnym 60x (NA 1,25), zestaw filtrów GFP (Chroma, wzbudzenie 470/40 nm, emisja 525/50 nm), zestaw filtrów mCherry (Chroma, wzbudzenie 572/35 nm, emisja 632/60 nm). Autofokus wykonano w świetle przechodzącym, korzystając z procedury autofokusa dostępnej w oprogramowaniu Softworx firmy Deltavision. Należy zauważyć, że obecnie istnieje szereg innych odpowiednich systemów autofokusa, takich jak Zeiss Definite Focus, Nikon Perfect Focus System oraz Leica Adaptive Focus Control.

3. Zaprogramuj eksperyment zgodnie z konfiguracją doświadczalną. Zaleca się wcześniejsze określenie ilości światła wymaganej dla konkretnych konstruktów, a także ustawień autofokusa dla innych mikroskopów do obrazowania poklatkowego lub innych bakterii przed rozpoczęciem właściwego eksperymentu. Krótsze czasy ekspozycji oraz mniejsza ilość światła wzbudzenia zminimalizują blaknięcie i fototoksyczność. Do procedury autofokusa używaj światła diaskopowego.

W eksperymentach z mikroskopii time-lapse opublikowanych w pracy de Jong et al. 2010 ⁵ zastosowano następujące ustawienia: klatki do filmów rejestrowano w odstępach 8 lub 12 minut, używając białego światła LED APLLC o natężeniu 10% i czasu ekspozycji 0,05 s dla obrazów w jasnym polu, światła ksenonowego o natężeniu 10% i czasu ekspozycji 0,5 s dla detekcji GFP oraz światła ksenonowego o natężeniu 32% i czasu ekspozycji 0,8 s dla detekcji mCherry. Surowe dane zapisywano przy użyciu oprogramowania softWoRx 3.6.0 (Applied Presicion). Autofokus zaprogramowano na kroki o wielkości 0,06 μm w całkowitym zakresie 1,2 μm.

4. Umieść przygotowany preparat (sekcja 2) w podgrzanej komorze środowiskowej mikroskopu i monitoruj wzrost pojedynczych komórek w monowarstwę mikrokolonii w temperaturze 30°C.

Wskazówki szczegółowe:

• Wybierz pojedyncze komórki znajdujące się w środkowej części podkładki agarowej. Krawędzie podkładki agarowej wysychają szybciej. Zapisz pozycję X,Y,Z za pomocą oprogramowania mikroskopu.
• Duże przemieszczenia stolika w kierunku X,Y i Z mogą zaburzyć strukturę agarozy i w konsekwencji utrudnić identyfikację komórek przez procedurę autofokusu. Aby zminimalizować ruch w osiach X,Y,Z, zazwyczaj nie wybieramy więcej niż 10 pozycji na eksperyment, nawet jeśli preparat zawiera wiele szczepów.
• Po wybraniu pierwszej komórki reguluj ostrość w osi Z wyłącznie za pomocą oprogramowania. Od tego momentu nie zmieniaj ostrości ręcznie na korpusie mikroskopu za pomocą pokrętła Z, chyba że jest ono kodowane cyfrowo. Upewnij się, że po każdej procedurze autofokusu nowa pozycja X,Y,Z zostaje zapisana przez oprogramowanie.
• Przed rozpoczęciem pomiaru sprawdź, czy ustawienia autofokusu są odpowiednie dla danego eksperymentu. Zastosowanie mikroskopii fazowo-kontrastowej może usprawnić działanie autofokusu w porównaniu do mikroskopii w jasnym polu lub DIC dzięki zwiększonemu kontrastowi. Jednak pierścień fazowy w obiektywach fazowo-kontrastowych sprawia, że są one mniej czułe (o około 10%) w zbieraniu światła fluorescencyjnego. Dlatego w przypadku próbek o słabej fluorescencji lepiej zastosować obiektyw bez pierścienia fazowego.
• Co pół godziny sprawdzaj, czy wybrane komórki są nadal w ostrości, aż do momentu stabilizacji przebiegu eksperymentu. Jeśli w tym momencie komórki będą poza zakresem ostrości, skoryguj to ręcznie. Ze względu na wahania temperatury oraz niedostatecznie wysuszone próbki, może być to konieczne w pierwszych godzinach. Ponadto, dzięki zwiększonemu kontrastowi, autofokus działa lepiej, gdy w polu widzenia znajduje się więcej komórek.

5. Po zakończeniu eksperymentu rozdziel poszczególne kanały filmu i zapisz je jako osobne pliki (np. kontrast fazowy, GFP, mCherry), jeśli jest to wymagane (niektóre pakiety akwizycyjne zapisują wszystkie kanały w jednym pliku składowym). Na potrzeby publikacji obrazy można ulepszyć za pomocą dekonwolucji 2D, co jest szczególnie przydatne w badaniach nad lokalizacją białek. Wykonaj dekonwolucję obrazów za pomocą oprogramowania do mikroskopu lub komercyjnego pakietu, takiego jak Huygens (www.svi.nl).
6. Przeanalizuj dane za pomocą programu ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) (do tego celu użyj surowych, nieprzetworzonych plików obrazów) oraz programu Microsoft Excel lub Sigma Plot. Stosy obrazów można na przykład zapisać w programie ImageJ jako plik filmowy ".avi". Szczegółowy opis sposobu pomiaru fluorescencji pojedynczych komórek w czasie znajduje się poniżej.

4. Analiza danych dynamiki aktywności promotora przy użyciu programu ImageJ

Zauważamy, że dostępne są inne wysokiej klasy pakiety oprogramowania wyspecjalizowane w analizie obrazów z mikroskopii time-lapse, takie jak oprogramowanie BHV ^{9, 4}, Schnitzcell ¹⁰, PSICIC ¹¹ oraz Microbe-Tracker ¹², jednak w niniejszej pracy skupiamy się na bezpłatnie dostępnym pakiecie ImageJ.

1. Pobierz program ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) oraz (jeśli jest to konieczne) odpowiednią wtyczkę do otwierania plików (stosek obrazów). Na przykład filmy zarejestrowane za pomocą mikroskopu deltavision można otworzyć w ImageJ tylko przy użyciu wtyczki deltavision opener. Skopiuj wtyczkę DV do folderu wtyczek ImageJ i uruchom program. Zmień pojemność pamięci w menu edit/option/memory&threads na 1250. Pozwala to na pracę z większymi plikami, takimi jak filmy z poklatkową rejestracją obrazu (time-lapse).
2. Aby ocenić historię pojedynczej komórki, otwórz oryginalny film w kontraście fazowym jednej mikrokolonii i przewiń do ostatniej interesującej klatki filmu. Wybierz przycisk zaznaczania „segmented lines” w menu.
3. Narysuj linię w tle i naciśnij „CTRL” + „T”. Otworzy to menedżera obszarów zainteresowania (ROI manager). (Odpowiadającą mu wartość fluorescencji tła można wykorzystać do ręcznego odjęcia tła – patrz poniżej. Alternatywnie można użyć procedury odejmowania tła dostępnej w programie ImageJ). Narysuj również linię w interesującej komórce i dodaj ten obszar ROI do menedżera ROI. Ponieważ w niniejszym studium przypadku badamy fuzje promotora z GFP, a GFP jest rozproszone w cytoplazmie, cała komórka powinna mieć podobne wartości fluorescencji dla każdego pojedynczego piksela na całej jej długości. Przewiń o jedną klatkę wstecz i zaznacz nowy obszar ROI w tej samej komórce. Zapisz ten trzeci obszar ROI i kontynuuj procedurę, aż zostanie zapisany odpowiedni obszar ROI w pierwszej klatce filmu.
   Należy pamiętać, że fluorescencja komórek potomnych może znacznie różnić się po podziale komórki. Można zastosować barwnik błonowy, który można podać razem z białkami fluorescencyjnymi produkowanymi przez komórki (np. kombinację czerwonego barwnika błonowego FM^® 5-95 (Invitrogen) i GFP), aby zwizualizować tworzenie przegrody. W tym przypadku do śledzenia komórek w czasie należy użyć odpowiedniego kanału fluorescencji, a nie filmu w kontraście fazowym. Alternatywnie, aby zachować ostrożność, można zaznaczać obszary ROI tylko w jednej połowie komórki.
4. W menedżerze ROI kliknij „save”. Jeśli rozszerzenie pliku to „.roi”, zostanie zapisany tylko jeden wybrany obszar z listy. Jeśli rozszerzenie pliku to „.zip”, zostanie zapisany cały zestaw (wymagane).
5. Zamknij film w kontraście fazowym i otwórz oryginalny film fluorescencyjny (np. GFP). W menedżerze ROI kliknij „show all” i „measure”. Otworzy się nowe okno (Results). Skopiuj wyniki do arkusza Excel i odejmij średnią fluorescencję każdej pojedynczej komórki od fluorescencji tła medium. Wynikową fluorescencję netto można przedstawić w funkcji czasu, aby ukazać aktywność promotora badanej komórki w czasie.
6. Alternatywnie można przeanalizować fluorescencję wszystkich komórek mikrokolonii w konkretnym punkcie czasowym. Aby to zrobić, zaznacz i zapisz obszary ROI dla tła i każdej pojedynczej komórki w jednej klatce, jak opisano powyżej, skopiuj wartości fluorescencji do programu Excel i utwórz histogramy za pomocą funkcji „histogram” w menu „tool”.
7. Aby uzyskać obrazy z pojedynczych klatek do publikacji, wybierz interesującą klatkę, wybierz „image” – „duplicate image” i zmień typ obrazu na „RGB” lub „8-bit”, wybierając „image” – „type” – „RGB color” lub „8-bit”. Zapisz zduplikowaną klatkę jako plik „.tiff”. Obrazy RGB/8-bit można otwierać za pomocą konwencjonalnych programów graficznych, takich jak CorelDraw lub Adobe Illustrator. W razie potrzeby obrazy można dostosować za pomocą funkcji „image” – „adjust” – „brightness/contrast” lub „image” – „adjust” – „window/level” w programie ImageJ.

5. Tworzenie filmów do publikacji za pomocą programu ImageJ

1. Otwórz oryginalny film w kontraście fazowym oraz odpowiadające mu filmy fluorescencyjne w programie ImageJ, zgodnie z powyższym opisem. Wybierz przycisk zaznaczania prostokątnego (1^st od lewej) i narysuj prostokątną ROI na pierwszej klatce w taki sposób, aby rozwijająca się mikrokolonia była zamknięta w obrębie ROI przez cały czas trwania filmu. Wybierz „image” - „crop” i zapisz tę mniejszą wersję filmu pod nową nazwą. Wybierz tę samą ROI za pomocą menedżera ROI w filmie fluorescencyjnym i postąp analogicznie.
2. Aby połączyć filmy poziomo lub pionowo, wybierz „plugin” - „stack combiner”. W razie potrzeby można dodać znacznik czasu poprzez „plugin” - „time stamper”. Zapisz połączony stos raz jako plik „.dv” lub „.tiff”, a raz jako film „.avi” lub QuickTime.

Alternatywne adaptacje protokołu dla Streptococcus pneumoniae (Rycina 4 i Film 2):

6. Przygotowanie kultur S. pneumoniae

1. Hodować komórki S. pneumoniae (szczep kapsułowany D39 ¹³ lub niekapsułowany R6 ¹⁴) jako kultury stojące w pożywce C+Y ¹⁵ w temperaturze 37°C do momentu osiągnięcia gęstości optycznej OD przy A_600nm wynoszącej około 0.4. Odwirować komórki przez 2 min przy 14000 rpm i resuspender osad komórkowy w objętości świeżej pożywki C+Y zawierającej 14.5% glicerolu (v/v), tak aby uzyskać A_600nm dokładnie równą 0.4. Rozdzielić komórki na alikwoty i przechowywać w temperaturze -80°C do późniejszego użycia.
2. Do mikroskopii poklatkowej pobrać alikwot wcześniej hodowanych komórek S. pneumoniae. Inokulować 4 ml świeżej pożywki C+Y w stosunku 1:100 komórkami z alikwoty przechowywanej w -80°C. Hodować komórki do środkowej fazy wzrostu wykładniczego, aż do osiągnięcia OD A_600nm na poziomie 0.1 - 0.2. Zazwyczaj trwa to około 2 godzin w przypadku użycia komórek z alikwotów -80°C.

7. Przygotowanie próbki do badania mikroskopowego

1. Przygotować preparat mikroskopowy zgodnie z powyższym opisem dla B. subtilis należy jednak upewnić się, że agar zawiera złożone pożywkę C+Y. Ponieważ S. pneumoniae jest mikroaerofilem, więc pęcherzyki powietrza między paskami agarozy powinny być mniejsze niż w przypadku B. subtilis (~1 mm odstępu po obu stronach).
2. Zmierz absorbancję hodowli przy 600 nm (A₆₀₀), rozcieńczyć komórki S. pneumoniae w fazie wzrostu wykładniczego do przybliżonej wartości A₆₀₀ wynoszącej 0,05 przy użyciu pożywki C+Y, a następnie użyć tego rozcieńczenia do załadowania szkiełka z agarozą.

8. Mikroskopia fazowo-kontrastowa w trybie time-lapse

Dostosuj ustawienia mikroskopu dla S. pneumoniae: zastosuj mikroskopię fazowo-kontrastową, ponieważ S. pneumoniae jest trudna do zidentyfikowania przy użyciu mikroskopii w polu jasnym. Kontynuuj protokół zgodnie z opisem dla B. subtilis (postępuj zgodnie z krokami 2.9 – 3.7). Komórki S. pneumoniae można hodować w temperaturze 30°C lub 37°C (rosną szybciej w 37°C).

9. Reprezentatywne wyniki:

Eksperyment fluorescencyjny time-lapse uznaje się za przeprowadzony pomyślnie, jeśli bakterie wyrosły w monowarstwę mikrokolonii, która w końcowej fazie eksperymentu znajduje się w całości w polu widzenia (patrz Ryc. 5A-C). W przypadku wzrostu komórek jedna na drugiej, niemożliwe jest nie tylko dokładne odtworzenie ich historii, ale także prawidłowy pomiar poziomów fluorescencji nakładających się komórek. Komórki mają tendencję do wzrostu jedna na drugiej, jeżeli naniesione komórki nie zostały wystarczająco wysuszone (krok 2.9) lub jeśli skład pożywki wymaga dostosowania w celu uzyskania wolniejszego wzrostu. Jeśli mikrokolonia wyrosła poza pole widzenia, nie można określić rozkładu sygnałów fluorescencji wewnątrz jednej kolonii. Przyczynami „przemieszczania się mikrokolonii” może być niewystarczające wysuszenie naniesionych komórek (krok 2.9) lub brak zaprogramowania oprogramowania do śledzenia mikrokolonii podczas jej rozwoju. Ponadto ważne jest, aby w pożywce nie występowały lokalne obszary zwiększonej fluorescencji, ponieważ przesłaniają one sygnały fluorescencji pochodzące z komórek (patrz Ryc. 5D-F). Problemy związane z tłem mogą wynikać z komponentów pożywki, pęcherzyków powietrza lub nierozpuszczonych grudek agarozy. Aby to zobrazować, na Ryc. 5F przedstawiamy sygnały tła dla tego konkretnego preparatu, gdy obraz był rejestrowany przy użyciu filtrów wzbudzenia/emisji dla czerwonych barwników fluorescencyjnych. Jak widać, obecne są jasne plamki autofluorescencyjne, które mogą utrudniać obrazowanie. Aby zapobiec powstawaniu takich plamek, należy upewnić się, że agaroza jest całkowicie rozpuszczona i że podczas nakładania szkiełka nakrywki na szkiełko przedmiotowe nie powstały pęcherzyki powietrza.

Rycina 1: Przegląd eksperymentu

Rycina 2: Przygotowanie próbki do badania mikroskopowego

Rycina 3: Mikroskopia fluorescencyjna time-lapse komórek B. subtilis zawierających fuzję P_kinB-gfp. Klatki zostały pobrane z Filmu 1. Panele górne: pole jasne, panele dolne: kanał GFP.

Rycina 4: Mikroskopia fazokontrastowa poklatkowa szczepu dzikiego R6 S. pneumoniae. Zrzuty ekranu pochodzą z Filmu 2.

Rysunek 5: Ilustracja możliwych wyników mikroskopii (time-lapse). A-C przedstawiają czynniki, które należy wziąć pod uwagę w przypadku danych uzyskanych przy ustawieniach oświetlenia diaskopowego. (A) Mikrograf w polu jasnym monowarstwy mikrokolonii (wynik pozytywny) sporulujących komórek B. subtilis (B) Obraz w polu jasnym mikrokolonii B. subtilis, w której niektóre komórki narosły na sobie (wynik negatywny) (C) Obraz w polu jasnym sporulującej mikrokolonii B. subtilis, która wyrosła poza płaszczyznę ostrości (wynik negatywny). D-F przedstawiają czynniki, które należy wziąć pod uwagę w przypadku danych uzyskanych przy ustawieniach oświetlenia episkopowego (D) Obraz w kontraście fazowym komórek B. subtilis w fazie wykładniczej, przedstawiony w celu wizualizacji pochodzenia sygnałów fluorescencji w E i F (E) Sygnały GFP komórek pokazanych w D. Należy zauważyć, że sygnały tła są podobne w każdym pikselu (wynik pozytywny). Należy również zauważyć, że czas ekspozycji może być zbyt długi, ponieważ jedna komórka wykazuje sygnał nasycony (wynik negatywny) (F) Sygnały uzyskane za pomocą kanału czerwonego dla komórek pokazanych w D. Należy zauważyć, że tło zawiera obszary o zwiększonym poziomie fluorescencji czerwonej (wynik negatywny).

Film 1. Mikroskopia fluorescencyjna time-lapse komórek B. subtilis zawierających fuzję P_kinB-gfp. Zdjęcia wykonano w odstępach 8 min. Lewo: pole jasne, Prawo: kanał GFP. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Film 2. Mikroskopia fazokontrastowa time-lapse szczepu dzikiego R6 S. pneumoniae. Zdjęcia wykonano w odstępach 10 min. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Dyskusja

W przeciwieństwie do wielu innych technik analizy pojedynczych komórek, opisana tutaj metoda mikroskopii fluorescencyjnej time-lapse może być wykorzystana do śledzenia historii konkretnej komórki w odniesieniu do jej przodków, zachowania oraz zdarzeń podziału. W połączeniu z fluorescencyjnie znakowanymi promotorami docelowymi lub białkami, można w czasie rzeczywistym śledzić aktywację specyficznych szlaków rozwojowych, a także monitorować lokalizację i dynamikę białek podczas rozwoju bakterii.

Jak wskazano powyżej, badania koncentrujące się na różnych gatunkach bakterii można przeprowadzić poprzez dostosowanie warunków hodowli do wymagań konkretnej bakterii. Jedynymi napotkanymi przez nas ograniczeniami były warunki wzrostu oraz wielkość próbki. Ze względu na szczelne środowisko, warunków pożywki nie można zmieniać w trakcie eksperymentu. Ponadto, w ramach jednego doświadczenia można efektywnie monitorować maksymalnie cztery szczepy.

Biorąc pod uwagę kilka krytycznych etapów, opisana tutaj metoda analizy pojedynczych komórek może zostać z łatwością zastosowana przy użyciu dowolnego mikroskopu automatycznego. Poniżej przedstawiono przegląd tych krytycznych etapów. Szczegółowe informacje znajdują się w tekście głównym. Przygotowanie ogólne: Zaleca się sprawdzenie ustawień autofokusu wymaganych dla konkretnej bakterii przed rozpoczęciem eksperymentu. Podobnie, jeśli to możliwe, należy wcześniej określić przybliżone optymalne ustawienia dla wizualizacji fluorescencji. Ponadto przestrzeganie przygotowanego harmonogramu pomaga w odpowiednim przygotowaniu wszystkich materiałów (podgrzanie komory mikroskopu, zaprogramowanie ustawień mikroskopu, przygotowanie szkiełka na godzinę przed osiągnięciem przez komórki pożądanej fazy wzrostu, patrz Ryc. 1). Wzrost B. subtilis w TLM i CDM: TLM i CDM są chemicznie zdefiniowanymi mediami głodzeniowymi, w których B. subtilis rośnie powoli. Czas hodowli komórek w tych mediach może wymagać przedłużenia w zależności od konkretnego szczepu. Wolny wzrost zapobiega nakładaniu się komórek na siebie. Przygotowanie próbki do mikroskopu: Należy zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza między ramką genu, szkiełkiem przedmiotowym a szkiełkiem nakrywką, aby uniknąć nadmiernego wysychania medium na bazie agarozy. To samo dotyczy styku medium ze szkiełkiem nakrywką. Kluczowe jest dopuszczenie do wystarczającego wyschnięcia komórek, aby zapobiec ich przemieszczaniu się i/lub wzrostowi wielowarstwowemu. Mikroskopia fluorescencyjna time-lapse: Podgrzanie szkiełka oraz komory środowiskowej jest kluczowe dla uniknięcia poważnych problemów z autofokusem. Komórki należy wybierać w środku podkładki agarowej, ponieważ mają one największą szansę pozostać w polu widzenia i w ostrości podczas eksperymentu (pod warunkiem, że próbka została wystarczająco wysuszona). Maksymalna liczba 10 lokalizacji na eksperyment wciąż pozwala na prawidłowe działanie. Po wybraniu pierwszej interesującej komórki należy używać oprogramowania wyłącznie do regulacji ostrości (szczegóły w tekście). W ciągu pierwszych godzin eksperymentu należy w odstępach 30 min sprawdzać, czy komórki nadal znajdują się w ostrości. Analiza: Przed przystąpieniem do rozszerzonych procedur analitycznych ważne jest sprawdzenie, czy tło medium ma podobne wartości w kanałach fluorescencji. Małe cząsteczki kurzu, składniki medium, zabrudzone soczewki lub maleńkie grudki agarozy mogą przyczyniać się do lokalnego zwiększenia fluorescencji, co utrudnia lub uniemożliwia analizę filmu. Rozwiązywanie problemów: Jeśli komórki rosną jedna na drugiej, może to wskazywać na zbyt wczesne nałożenie szkiełka nakrywki lub na to, że medium nie nadaje się do wzrostu monowarstw mikrokolonii. Jeśli interesujące komórki stale obumierają przedwcześnie, podczas gdy inne komórki na szkiełku dzielą się prawidłowo, należy sprawdzić, czy filtr UV został ustawiony w odpowiedniej pozycji. Podczas długich eksperymentów pomocne może być również skrócenie czasu ekspozycji lub zmniejszenie natężenia światła.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ramka odczytu genu	ABgene Limited	AB-0578	1,7 x 2,8 cm
agaroza niskotopliwa o wysokiej rozdzielczości	Sigma-Aldrich	A4718
duże szkiełko nakrywkowe	Wielu dostawców		24 x 50 mm
opcjonalnie barwnik błonowy, np. FM 5-95	Invitrogen	T23360	dostępne są również inne barwniki membranowe: **Sonda TaqMan Gene Expression Assay** **Przegląd** Sondy TaqMan Gene Expression Assay umożliwiają precyzyjną i czułą analizę ilościową ekspresji genów w próbkach RNA za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR). Każdy zestaw zawiera specyficzną parę starterów oraz sondę fluorescencyjną, które zostały zoptymalizowane pod kątem wydajności i specyficzności w celu zapewnienia dokładnego pomiaru poziomu mRNA konkretnego genu. **Zasada działania** Sondy TaqMan wykorzystują mechanizm transferu energii w rezonansie (FRET). Sonda składa się z oligonukleotydu z przyłączonym do jednego końca fluoroforem (reporterem), a do drugiego wygaszaczem (quencherem). Dopóki sonda pozostaje nienaruszona, wygaszacz hamuje sygnał fluorescencyjny reportera. Podczas fazy wydłużania PCR, polimeraza DNA z aktywnością egzonukleazy 5' $\rightarrow$ 3' degraduje sondę, co powoduje oddzielenie reportera od wygaszacza i emisję sygnału fluorescencyjnego proporcjonalnego do ilości syntetyzowanego produktu PCR. **Zalety** * **Wysoka specyficzność:** Zastosowanie zarówno starterów, jak i sondy, zapewnia podwójną weryfikację sekwencji docelowej. * **Kwantyfikacja w czasie rzeczywistym:** Pozwala na monitorowanie amplifikacji w każdym cyklu. * **Zoptymalizowane parametry:** Każdy assay jest testowany pod kątem wydajności i specyficzności. * **Kompatybilność:** Możliwość pracy z wieloma systemami qPCR i różnymi barwnikami fluorescencyjnymi. **Zalecany protokół** **1. Przygotowanie cDNA** Przed przeprowadzeniem qPCR należy przekształcić wyizolowane RNA w cDNA za pomocą odwrotnej transkrypcji (RT). Zaleca się stosanie wysokiej jakości zestawów do syntezy cDNA, aby zapewnić reprezentatywność próbki. **2. Warunki reakcji qPCR** Sondy TaqMan Gene Expression Assay są zoptymalizowane do pracy z standardowymi mieszankami Master Mix do qPCR zawierającymi polimerazę DNA i dNTP. Typowy program termiczny: * **Denaturacja wstępna:** 95°C przez 2–10 minut. * **Cykle (40 cykli):** * Denaturacja: 95°C przez 15 sekund. * Przyłączanie i wydłużanie: 60°C przez 1 minutę. **3. Analiza danych** Po zakończeniu reakcji qPCR należy przeanalizować krzywe amplifikacji i wyznaczyć wartość Ct (cykl progowy). Do względnej kwantyfikacji ekspresji genów zaleca się metodę $\Delta\Delta$Ct z wykorzystaniem genu referencyjnego (tzw. genu housekeeping), aby znormalizować ilość cDNA w każdej próbce. **Przechowywanie i stabilność** Przechowywać w temperaturze -20°C. Unikać częstych cykli zamrażania i rozmrażania poprzez przygotowanie aliquotów. **Uwagi** * Zawsze stosuj odpowiednie środki ostrożności przy pracy z materiałami biologicznymi. * Przechowuj wszystkie odczynniki w temperaturze 4°C podczas przygotowywania reakcji.
Mikroskop do obrazowania poklatkowego z komorą inkubacyjną	Wielu dostawców		szczegółowe informacje na temat naszego urządzenia znajdują się w odpowiednich sekcjach