Obrazowanie oparte na immunocytochemii do wizualizacji migracji komórek glejaka u dzieci

Streszczenie

Źródło: Pericoli, G. et. al., Testy immunocytochemiczne żywych komórek 3D rozlanego glejaka linii środkowej u dzieci. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film przedstawia obrazowanie żywych komórek w celu obserwacji migracji komórek glejaka rozlanego w linii środkowej u dzieci za pomocą znakowania immunohistochemicznego przeciwciałami anty-CD44.

Protokół

1. Generowanie sferoidów nowotworowych o powtarzalnej wielkości

1. Zbierz rozlanego glejaka linii środkowej (DMG) H3K27M-mutant neurosfery (NS) i odwiruj przy 170 x g przez 10 minut (min) w temperaturze pokojowej (RT).
2. 7 i odwirować zawieszenie komórki przy 355 x g przez 5 minut w RT.
3. ³ Table of Materials2. Przygotowanie odczynnika do znakowania przeciwciał (ALR)/kompleksu przeciwciał i przygotowanie do testu migracji
   1. Weź pod uwagę liczbę studzienek do analizy i oblicz objętość potrzebną dla każdego odczynnika. Należy również uwzględnić studzienki potrzebne do kontroli ujemnych. Przed rozpoczęciem sprawdź wizualnie NS za pomocą odwróconego mikroskopu.
   2. UWAGA: UWAGA: UWAGA:₂3. Ustawienie instrumentu do analizy komórek na żywo do pozyskiwania obrazów
      1. Zeskanuj płyty za pomocą przyrządu do analizy komórek na żywo (specyfikacje, zobacz Tabela Materials) z interwałami skanowania zaczynającymi się od punktu zerowego (t0) testów inwazji i migracji ustawionych, odpowiednio, po kroku 2.14. oraz 3.10. do 96 godzin.
         UWAGA:Schedule to Acquire. Kliknij na + tab i wybierz opcję Scan on Schedule.
      2. Create or restore Vessel, kliknij opcję New.
      3. Spheroid typ skanowania, obiektyw 4x, Phase+Brightfield oraz Green kanały obrazu do testu inwazji. Wybierz Klonowanie rozcieńczenia typ skanowania, obiektyw 4x i Phase and andGreen dla testu migracji.
      4. Dodaj do harmonogramu i rozpocznij skanowanie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
96 dobrze Mikropłytki poddane TC	Corning	3595	Rozmiar 96 dołków, płyta polistyrenowa, płaskie dno
Accutase	Euroclone	ECB3056D	Rozwiązanie dla dysocjacji neurosfery
komora Burkera	Mv medical	FFL16034	Komora do liczenia komórek
CD-44 (156-3C11)	Technologia sygnalizacji komórkowej	3570	Mouse mAb IgG2a
Corning Matrigel Matrix	Corning	356237	Matryca membrany podstawnej (BMM), bez czerwieni fenolowej, bez
Barwnik do znakowania przeciwciał Fabfluor-488	Incucyte	4743	Odczynnik do oznaczania przeciwciał (ALR): mysie przeciwciało IgG2a 488 do immunocytochemii
Przyrząd do analizy żywych komórek Incucyte S3 i/lub SX5	Sartorius	-	Instrument Incucyte S3 i/lub SX5 jest używany do monitorowania i nadzoru komórek w czasie rzeczywistym, zdrowia i żywotności komórek, migracji i inwazji, a także do szerokiego zakresu testów fenotypowych opartych na komórkach.
Mikroskop odwrócony		-	Dowolny mikroskop
Odczynnik tłumiący tło Opti-Green	Incucyte	6500-0045	Odczynnik tłumiący tło (BSR)
Komórka macierzysta nowotworu (TSM) średnia	-	-	Podłoże komórek wzrostu (szczegóły w tekście)

LDEV żywych komórek odwrócony