Pomiar wskaźnika zużycia tlenu w ostrych wycinkach mózgu myszy

Streszczenie

Źródło: Zhi, L. i wsp., Pomiar wskaźnika zużycia tlenu w ostrych plastrach prążkowia od dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2022).

Ten film pokazuje, jak mierzyć wskaźnik mitochondrialnego zużycia tlenu (OCR) w wycinkach mózgu myszy z prążkowiem. Szczegółowo opisano w nim etapy przygotowania płytki tkankowej i wkładu czujnika, załadowania ich do analizatora strumienia oraz wyjaśniono procesy komórkowe leżące u podstaw wzorców OCR.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Uwodnić czujniki z wkładem (1 dzień przed testem)

1. Otwórz zestaw do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego (patrz Tabela materiałów) i wyjmij zarówno wkład czujnika (zielony), jak i tabliczkę użytkową (przezroczysta; Rysunek 1A). Odłóż wkład czujnika na bok (czujniki do góry) i nie dotykaj czujników.
2. Dodać 600 μl roztworu kalibru (pH 7,4) do każdego dołka płytki użytkowej. Umieść wkład czujnika na górze płytki użytkowej i zanurz czujniki w roztworze kalibru. Upewnij się, że trójkątne wycięcie w płytce narzędzia i wkładu czujnika są prawidłowo wyrównane (Rysunek 1B).
3. Uszczelnij zestaw do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego folią uszczelniającą, aby zapobiec parowaniu roztworu kalibru, a następnie umieść go w inkubatorze o temperaturze 37 °C, nieuzupełnionym CO₂ lub tlenem.

2. Przygotuj płytkę tkankową (w dniu testu)

1. Otwórz mikropłytkę wychwytującą wychwyt wysepki i wyjmij płytkę wychwytującą wyspę trzustkową do umieszczenia w tkance.
2. Ogrzać odpowiednią objętość (625 μl na studzienkę) wstępnie natlenionego zmodyfikowanego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF, skład 140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl₂, 1,3 mM MgSO₄, 0,3 mM KH₂PO₄, 25 mM glukozy, 10 mM HEPES, pH 7,2) buforować do 37 °C w probówce o pojemności 50 ml. Następnie dodać BSA do końcowego stężenia 4 mg/ml w celu przygotowania buforu oddechowego. Ogólnie rzecz biorąc, 50 ml wystarcza na jedną płytkę.
3. Ostrożnie dodać 625 μl buforu oddechowego (wstępnie natleniony bufor ACSF z 25 mM glukozy i 4 mg/ml BSA) do każdego dołka płytki wysepki i unikać potrząsania płytką. Upewnij się, że na wierzchu wkładu czujnika nie znajdują się żadne resztki kropli, a w buforze każdej studzienki nie ma pęcherzyków powietrza.

3. Przygotowanie ostrego plastra prążkowia i umieszczenie wyciętego plastra

1. Odetnij głowę myszy po zwichnięciu szyjki macicy i natychmiast wypreparuj mózg w 10 ml lodowatego, wstępnie natlenionego roztworu tnącego (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 3,7 mM MgSO₄, 0,3 mM KH₂PO₄, 10 mM glukozy, pH 7,4).
2. Przekrój koronalne wycinki prążkowia za pomocą wibratomu zgodnie z instrukcją producenta (patrz Tabela materiałów) o grubości 150 μm w lodowatym, wstępnie natlenionym roztworze do cięcia.
3. Odzyskaj plastry w 50 ml natlenionego ACSF (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 2,4 mM CaCl₂, 1,3 mM MgSO₄, 0,3 mM KH₂PO₄, 10 mM glukozy, 2 mM HEPES, pH 7,4) i przechowywać w roztworze do 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
4. Po wyzdrowieniu przenieść plastry na szalkę Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm z 5 ml buforu oddechowego.
5. Użyj stempla do biopsji ze stali nierdzewnej (np. o średnicy 1,5 mm), aby utworzyć okrągły kawałek tkanki w pożądanym obszarze pokrojonego mózgu. Trzymaj plasterek w buforze, delikatnie dociskając stemplem. Upewnij się, że stempel jest dociśnięty wystarczająco mocno, aby przeciąć tkankę. Usuń resztę tkanki, podnieś stempel i wyjmij okrągły kawałek tkanki do bufora.
6. Odetnij ostatni koniec końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby zrobić otwór o średnicy 1,5-2,0 mm i użyj go do przytrzymania i przeniesienia dziurkowanego plasterka na górę ekranu przechwytywania. Odessać jeden kawałek przebitej tkanki mózgowej i ostrożnie umieścić tkankę po siatkowej stronie ekranu przechwytywania (Rysunek 2A). Ekran przechwytywania będzie okrągłym kawałkiem plastiku z siatką przymocowaną z jednej strony.
   UWAGA: Ekrany przechwytywania są dołączone do zestawu mikropłytek (patrz Tabela materiałów).
7. Delikatnie użyj chusteczki papierowej, aby na krótko wysuszyć ekran przechwytywania. Po usunięciu wilgoci tkanka staje się lepka, co pozwala plasterkowi przymocować się do środka siatki. Nie susz plastra zbyt mocno, ponieważ w przeciwnym razie zostanie uszkodzony.
8. Przytrzymaj pęsetą ekran przechwytywania stroną do dołu i umieść go w jednym z dołków płytki wysepki inkubującej (Rysunek 2B). Uważaj, aby nie upuścić plasterka; Jeśli tak, wyjmij ekran i umieść na nim nowy plasterek.
   UWAGA: Nie umieszczaj wycinków mózgu w dwóch dołkach korekcyjnych tła (A1 i D6) w płycie wysepki.
9. Inkubować płytkę wysepki w temperaturze 37 °C w inkubatorze przez co najmniej 30 minut, aby umożliwić zrównoważenie temperatury i pH przed uruchomieniem testu.

4. Ładowanie wkładów z pożądanymi związkami

1. Rozcieńczyć pożądane związki w zmodyfikowanym ACSF (37 °C) do końcowego stężenia wyjściowego odpowiednio 10x, 11x, 12x i 13x stężenia roboczego dla portów A do D i dostosować do pH 7,4. Test będzie podawał związki w kolejności od portu A do D. W tym doświadczeniu użyto następujących roztworów, których odpowiednie stężenie robocze było wspomniane wcześniej: 10 mM pirogronianu (port A), 20 μM oligomycyny (port B), 10 μM lub inne stężenia 4-(trifluorometoksy) fenylohydrazonu cyjanku karbonylu (FCCP) (port C) i 20 μM antymycyny A (port D).
2. Delikatnie załaduj wstępnie 75 μl rozcieńczonych związków do odpowiednich portów iniekcyjnych wkładu czujnika. Umieścić końcówki do połowy w otworach iniekcyjnych pod kątem 45°, tak aby końcówka przylegała do ścianki otworu iniekcyjnego. Końcówek nie należy wkładać całkowicie na dno otworów iniekcyjnych, ponieważ może to spowodować wyciek związku przez port.
3. Ostrożnie wyjmij końcówki z portów, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza. Nie stukaj w żadną część wkładu, aby uniknąć złagodzenia pęcherzyków powietrza.
4. Sprawdź wzrokowo porty wtryskowe pod kątem równomiernego obciążenia. Upewnij się, że cała ciecz znajduje się w porcie i nie ma żadnych resztek kropel na górze wkładu.
5. Umieść wkład czujnika na tabliczce użytkowej i umieść go w inkubatorze (non-CO₂) na 30 minut, aby ponownie nagrzał się do 37 °C. Obchodź się ostrożnie, trzymając się tylko za tabliczkę użytkową. Ruszaj się tak mało, jak to możliwe.

5. Kalibracja i wykonanie testu

1. Załaduj szablon testu do oprogramowania. Naciśnij zielony przycisk START .
2. Upewnij się, że załadowany jest prawidłowy protokół. Protokół zawiera kombinację 3-minutowych sekwencji pomiarowych, 3-minutowego oczekiwania i 2-minutowego pomiaru (te trzy kroki tworzą jeden pomiar). Zmień odległość głowicy sondy z 26 600 na 27 800 w ustawieniach sprzętowych w ustawieniach przyrządu. Nie ma potrzeby wymiany głowicy sondy w analizatorze XFe24. Naciśnij START.
3. Załaduj wkład czujnika z tabliczki narzędziowej do tacy na instrumenty. Wycięcie znajduje się w lewym przednim rogu. Upewnij się, że płyta jest prawidłowo osadzona i płaska. Załaduj wypełniony lekiem wkład czujnika do analizatora w celu kalibracji.
4. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby skalibrować i zrównoważyć czujniki. Zajmuje to około 30 minut.
5. Po zakończeniu etapu kalibracji wyjmij płytkę kalibracyjną i zastąp ją płytką wysepkową (zawierającą siatkę i plastry tkanki).
6. Zmierz zużycie tlenu w każdym dołku płytki przy użyciu protokołów testów. Protokół zawiera kombinację 3-minutowego mieszania, 3-minutowego oczekiwania i 2-minutowych sekwencji pomiarowych (te trzy kroki tworzą jeden pomiar), w którym to momencie obliczany jest wskaźnik zużycia tlenu (OCR).
7. Dla całego eksperymentu uwzględnij 4-krotne pomiary OCR w celu stworzenia linii bazowej, a następnie wstrzyknięcie portu A (pirogronianu) z 4-krotnymi pomiarami, następnie wstrzyknięcie portu B (oligomycyny) z 8-krotnymi pomiarami, następnie wstrzyknięcie portu C (FCCP) z 5-krotnymi pomiarami, a na koniec wstrzyknięcie portu D (antymycyna A) z 6-krotnymi pomiarami.
   UWAGA: Ta liczba pomiarów po każdym wstrzyknięciu związku jest określana w zależności od tego, kiedy pomiar osiąga plateau.
8. Przeanalizuj dane pomiarowe OCR i dane dotyczące wydajności sprzężenia.

Wyniki

Rysunek 1: Obrazy przedstawiające czujniki i płytkę z analizatorem strumienia zewnątrzkomórkowego, hydratem. (A) Wkład czujnika umieszczony na płytce kalibracyjnej (płytce użytkowej). (B) Widok z boku tabliczki użytkowej...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Laboratoryjny miernik pH Accumet AB150	Thermo Fisher Scientific	13-636-AB150	Mierzyć pH
Antimycyna A z Streptomyces sp.	SIGMA	A8674	Aby zahamować kompleks III mitochondriów
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	SIGMA	A6003	Aby zrobić zmodyfikowany sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (BSA-ACSF)
Cyjanek karbonylu 4-( trifluorometoksy) fenylohydrazon (FCCP)	SIGMA	C2920	Aby rozdzielić oddychanie mitochondrialne
D-Glucose	SIGMA	G8270	Aby zrobić sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF)
DMSO	D8418	Aby rozdzielić związki
HEPES	SIGMA	H3375	Aby wytworzyć sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF)
Nawilżany inkubator dwutlenku węgla	Fisher Scientific	11-683-230D	Aby nawodnić talerze w temperaturze 37 °C
Oligomycyna ze Streptomyces diastatochromogenes	SIGMA	O4876	Aby zahamować mitochondrialną syntazę ATP
Parafilm	SIGMA-ALDRICH		sealing film
Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL	103681-100	Rozwiązanie do kalibracji konika morskiego
Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer	Seahorse Bioscience		Sprzęt używany do analizy wskaźnika zużycia tlenu, stara generacja
Konik morski XFe24 Extracellular Flux Analyzer	Seahorse Bioscience		Sprzęt używany do analizy wskaźnika zużycia tlenu, nowa generacja
Seahorse XF24 FluxPaks	Seahorse Bioscience	101174-100	Pakiet wkładów czujników analizatora strumienia, płytek do hodowli tkankowych, ekranów przechwytywania, roztworu kalibracyjnego i płytek kalibracyjnych; zestaw do testów.
Pirogronian sodu	SIGMA	P2256	Aby zapobiec wszelkim ograniczeniom podaży substratu
Stemple do biopsji ze stali nierdzewnej	Miltex		Urządzenie używane do dziurkowania plasterków
Sterylne naczynie do hodowli komórkowych, 35 x 10 mm	Eppendrof	30700102	Używane do dziurkowania w plastry
Wibratome	Leica	VT1200	Aby przeciąć tkankę mózgową
Kąpiel wodna	Thermo Scientific Precision	282-115	Aby podgrzać bufor i roztwory