Pomiary inwazji komórek raka mózgu oparte na impedancji

Streszczenie

Źródło: Mudduluru, G., et. al. Oparty na impedancji pomiar migracji i inwazji komórek rakowych w czasie rzeczywistym. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film przedstawia test oparty na impedancji do pomiaru inwazji i migracji komórek glejaka. Komórki degradują macierz zewnątrzkomórkową, przemieszczają się przez mikroporowate błony i przylegają do elektrod, generując impedancję. Ta analiza w czasie rzeczywistym odzwierciedla ich potencjał inwazyjny w zastosowaniach badawczych nad rakiem.

Protokół

1. Przygotowanie systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym, płytek do inwazji i migracji komórek (CIM) oraz elektroporowanych ogniw U-118MG do galwanizacji

1. Umieść system analizy komórek w czasie rzeczywistym w inkubatorze CO₂ w warunkach hodowli 5–6 godzin przed rozpoczęcie eksperymentu w celu ustabilizowania systemu do warunków hodowli.
2. Do testu inwazji należy umieścić na płytce 50 μl DMEM (zwykłego podłoża) zawierającego żel z matrycą zewnątrzkomórkową (ECM) w ilości 0,1 μg/μl w każdym dołku górnej komory płytki CIM. Aby uniknąć pęcherzyków powietrza, należy stosować metodę pipetowania odwrotnego. Natychmiast usuń 30 μl żelu ECM, pozostawiając 20 μl w studzience.
3. Po nałożeniu powłoki żelowej ECM należy przechowywać płytkę w inkubatorze w warunkach hodowli przez 4 godziny pod pokrywą. Podczas powlekania i suszenia żelu ECM należy podjąć środki zapobiegawcze, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z elektrodami górnej komory płytek z rękami, powierzchniami komory bezpieczeństwa biologicznego lub inkubatorem CO₂.
4. Aby skonfigurować program do pomiaru impedancji, kliknij dwukrotnie powiązaną ikonę oprogramowania (patrz Tabela materiałów), aby otworzyć aplikację systemową (jednostkę sterującą). Każda kołyska ma indywidualne okno z różnymi zakładkami do ustawiania warunków eksperymentu, interwału czasowego pomiaru impedancji i czasu trwania oraz analizy danych.
5. W zakładce Layout ustaw poczwórne studzienki dla każdego stanu biologicznego i ustaw dwuetapowe pomiary impedancji komórek w zakładce Schedule. Pierwszym krokiem jest jednorazowy pomiar linii bazowej (jedno przemiatanie w odstępie 1 minuty), a drugim krokiem jest pomiar impedancji ogniw w odpowiednich indywidualnych kołyskach do rzeczywistego eksperymentu. W przypadku migracji należy użyć 145 przemiatania z 10-minutowym interwałem, a w przypadku inwazji 577 przemiatania z 10-minutowym interwałem, ustawianym indywidualnie) w odpowiednich indywidualnych kołyskach.
6. Na godzinę przed rozpoczęciem pomiaru impedancji ogniwa dodaj 160 μL DMEM z 10% FBS jako chemoatraktantem do studzienek dolnej komory płytki. Połączyć górną komorę zawierającą studzienki pokryte żelem ECM lub studzienki niepowlekane z dolną komorą w celu zmierzenia odpowiednio inwazji i migracji.
7. Napełnij studzienki w górnej komorze 50 μl pożywki o niskiej surowicy i umieść je w kołysce systemu. Sprawdź, czy wszystkie studzienki są rozpoznawane przez jednostkę sterującą, klikając zakładkę Message. Jeśli komunikat jest wyświetlany jako OK, płytka w kołysce jest gotowa do eksperymentu.
8. Preinkubuj całkowicie wypełnione płytki w inkubatorze w warunkach hodowli przez 1 godzinę przed pomiarami w kołysce systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym, który jest niezbędny do aklimatyzacji wypełnionej płytki do warunków hodowli komórkowej.
9. W przypadku pobierania komórek potraktowanych pożywką o niskiej surowicy, umyj komórki rosnące w szalkach hodowlanych 1x PBS i dodaj 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy). Umieścić w inkubatorze na 30 s i usunąć trypsynę-EDTA. Zbierz komórki w niskiej surowicy do probówki o pojemności 15 ml i policz komórki za pomocą ręcznego automatycznego licznika komórek.
10. Po zliczeniu odwirować komórki w temperaturze 100 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
11. Ponownie zawiesić 800 000 komórek w 800 μl pożywki o niskiej surowicy do testów migracji i inwazji. Dodatkowo ponownie zawieś 300 000 komórek w 2 ml pożywki hodowlanej i wysiew w naczyniu 35 mm do analizy Western blot, aby potwierdzić regulowany knockdown Crk i CrkL.

2. Odczyt linii bazowej, zasiewanie komórek, oraz Pomiar i wizualizacja impedancji komórek

1. Zmierz odczyt linii bazowej, klikając kołyskę Start. Linię bazową należy odczytać po wstępnej inkubacji płytek przez 1 godzinę w kołysce systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym w warunkach hodowli w inkubatorze dwutlenku węgla oraz przed wysiewem komórek do odpowiednich studzienek w górnej komorze.
   UWAGA: Po kliknięciu przycisku Kołyska Start zostanie kliknięta, jednostka sterująca zapyta, czy zapisać plik eksperymentalny. Po zapisaniu pliku analizator stacji dokującej mierzy impedancję komórki bazowej zgodnie z początkowym ustawieniem w programie i przechodzi w tryb pauzy, dopóki przycisk Cradle Start zostanie ponownie kliknięty, aby zmierzyć impedancję komórki w drugim kroku.
2. Po pomiarze podstawowym wyjąć obie płytki do migracji i inwazji z kołysek i przechowywać je w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
3. Zasiać 100 μl komórek (100 000 komórek) w poczwórnych duplikatach dla każdego stanu biologicznego w górnej komorze płytki CIM w odpowiednich dołkach, zgodnie z programowaniem w jednostce sterującej kołyski, poprzez odwrotne pipetowanie, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
4. Po wysianiu trzymaj płytkę pod szafką bezpieczeństwa biologicznego przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby komórki równomiernie opadły na dno. Przenieś płytkę z powrotem do odpowiedniej podstawki i kliknij przycisk start podstawki, aby rozpocząć pomiar impedancji ogniwa zgodnie z programowaniem w drugim kroku 1.5.
5. Po ostatnim zamiataniu eksperyment zostaje zakończony, a wyniki są zapisywane automatycznie.
6. W zakładce Analiza danych wizualizuj zmiany impedancji komórek jako indeks komórek w sposób zależny od czasu w trakcie lub po zakończeniu eksperymentu. Każdy z odpowiednich warunków poczwórnych duplikatów może być wizualizowany indywidualnie lub jako średnie i/lub odchylenia standardowe, klikając pola Options dla średniej i odchylenia standardowego.
7. Aby wyeksportować dane indeksu komórek do pliku arkusza kalkulacyjnego, otwórz pusty plik arkusza kalkulacyjnego, umieść kursor w środku okna Analizy danych i kliknij prawym przyciskiem myszy. W wyświetlonym oknie dialogowym wybierz opcję Kopiuj dane do formatu listy i wklej dane do otwartego arkusza kalkulacyjnego.
8. Dostosuj czas w surowych danych, aby reprezentował rzeczywisty czas rozpoczęcia pomiaru impedancji ogniwa. Czas rozpoczęcia drugiego kroku jest ustawiony na zero.
   UWAGA: Jednostka sterująca ma możliwość uzyskania indeksu komórki z normalizacją lub bez niej (tj. znormalizowanego indeksu komórki) i wizualizacji wyników w formie prezentacji graficznej w sposób zależny od czasu. W tym przykładzie dane indeksu komórek są eksportowane bez normalizacji w celu przetworzenia i prezentacji graficznej.
9. Zwolnij eksperyment, klikając przycisk Release w każdej kołysce.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szafa bezpieczeństwa biologicznego	ThermoFisher Scientific	1300 Series Class II, typ A2
płyty CIM	Dział Analizy Komórek Agilent Technologies, Inc	5665825001	Płytki
Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM)	ATCC	302002	Pożywka hodowlana używana do komórki culture
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)	Gibco	21-031-CV	DPBS używany do mycia komórek
Surowica bydlęca (FBS)	Hyclone	SH30910.03
Inkubator dwutlenku węgla Heracell VIOS 160i	ThermoFisher Scientific	51030285	Inkubator
Matrigel	BD Bioscience	354234	Żel
Oprogramowanie RTCA	Dział Analizy Komórkowej firmy Agilent Technologies, Inc		Przyrząd używany do eksperymentu
Berło	Millipore	C85360	Ręczny automatyczny licznik
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
U-118MG	ATCC	ATCC HTB15	Linie komórkowe używane do eksperymentów
xCELLigence RTCA DP	Dział Analizy Komórek Agilent Technologies, Inc	380601050

inwazji i migracji komórek dwutlenku węgla do macierzy zewnątrzkomórkowej komórek