Stymulacja wewnątrzsercowego układu nerwowego w celu oceny podatności na arytmię

Streszczenie

Źródło: Jungen, C., et al. Wpływ neuronów wewnątrzsercowych na elektrofizjologię serca i arytmogenezę w Ex vivo systemie Langendorffa. J. Vis. Exp. (2018).

Film przedstawia technikę ex vivo stymulacji wewnątrzsercowego układu nerwowego w celu oceny podatności serca na arytmię. Za pomocą aparatu perfuzyjnego izolowane serce myszy jest perfundowane z natlenionym buforem. Wewnątrzsercowy układ nerwowy jest następnie stymulowany z dużą częstotliwością w celu wywołania arytmii.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Przygotowanie aparatu Langendorffa

UWAGA: Stosowany jest dostępny na rynku system perfuzyjny Langendorffa.

1. Przygotować zmodyfikowany roztwór Krebsa-Henseleita (119 mM chlorku sodu, 25 mM wodorowęglanu sodu, 4,6 mM chlorku potasu, 1,2 mM jednozasadowego fosforanu potasu, 1,1 mM siarczanu magnezu, 2,5 mM chlorku wapnia, 8,3 mM glukozy i 2 mM pirogronianu sodu). Aby zapobiec wytrącaniu się wapnia, dodaj mieszaninę 95% tlenu/5% dwutlenku węgla do roztworu perfuzyjnego. Przefiltruj bufor o wielkości porów 0,22 μm.
2. Dodaj środek farmakologiczny do buforu, aby zbadać jego wpływ na elektrofizjologię serca i arytmogenezę w razie potrzeby.
3. Rozpocznij łaźnię wodną i umieść w niej roztwór perfuzyjny zawierający mieszaninę 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Dostosuj temperaturę łaźni wodnej tak, aby temperatura roztworu perfuzyjnego bezpośrednio przed kaniulą wynosiła ~37 °C.
4. Gdy tylko zostanie osiągnięta prawidłowa temperatura, uruchom pompę rolkową i napełnij aparat roztworem perfuzyjnym.
5. Wyreguluj szybkość pompy przed podłączeniem serca, tak aby podczas montażu kaniuli w kaniuli nie pozostały pęcherzyki powietrza.

2. Przygotowanie sprzętu i oprogramowania

1. Podłącz cyfrowy system akwizycji danych i odpowiadające mu oprogramowanie do aparatu Langendorffa w celu ciągłego rejestrowania ciśnienia perfuzji, natężenia przepływu i tętna.
   1. Ustaw docelowe ciśnienie perfuzji w ustawieniach ogólnych na 80 mmHg.
   2. Rozpocznij nagrywanie.
2. Do rejestrowania danych i stymulacji za pomocą dedykowanego cyfrowego generatora bodźców należy użyć cewnika do elektrofizjologii z elektrodami platynowymi, o powierzchni elektrody 0,5 x 0,5 mm i odstępie między elektrodami 0,5 mm.
   1. Umieść cewnik blisko obszaru, w którym zostanie umieszczone serce po podłączeniu do aparatu.
   2. Przygotuj stymulację, wybierając 2 elektrody z cewnika i użyj cyklu o długości 100 ms.

3. Przygotowanie serca

1. Dodać zimny (~2 - 4 °C) bufor perfuzyjny (10 - 20 ml i 40 - 50 ml, tak aby cała szalka była pokryta) do 2 szalek Petriego (o średnicy 6 cm i 10 cm) i szalki z kaniulą, i umieść je na lodzie bezpośrednio obok i pod mikroskopem. Przygotuj podwójny węzeł wokół kaniuli.
2. Szybko wyciąć serce po zwichnięciu szyjki macicy, otwierając klatkę piersiową za pomocą nożyczek Mayo i kleszczy o wąskim wzorze. Następnie chwyć aortę i żyłę główną nad przeponą za pomocą kleszczy londyńskich i wyciąć blok płuco-serce, przecinając wszystkie naczynia i tkankę łączną w pobliżu kręgosłupa nożyczkami do zeza.
3. Przenieś blok płuco-serce do pierwszego naczynia (o średnicy 6 cm) wypełnionego lodowatym buforem i ostrożnie usuń płuca bez uszkadzania serca za pomocą nożyczek do zeza i kleszczy londyńskich. Następnie umieść serce pod mikroskopem i ostrożnie usuń grasicę, przełyk i tchawicę za pomocą nożyczek sprężynowych i kleszczy Dumont SS.
4. Za pomocą nożyczek sprężynowych wyciąć otwór o średnicy 1,5 - 2 mm w górnej części prawego przedsionka w celu wprowadzenia cewnika. Wytnij dziurę w tętnicy płucnej. Następnie przetnij aortę bezpośrednio pod gałęziami nadaortalnymi i usuń tkankę, aby można było łatwo przymocować węzeł.
5. Utrzymuj poduszeczki tłuszczowe przedsionków, w tym główną splot zwojową zlokalizowaną przedsionkowo, wokół lewego przedsionka w stanie nienaruszonym lub całkowicie je usuń przez staranne rozwarstwienie.
6. Przenieś serce do naczynia z kaniulą i umieść je pod mikroskopem. Przeciągnij aortę przez kaniulę za pomocą kleszczyków Dumont SS i zawiąż przygotowany węzeł ciasno wokół aorty. Upewnij się, że kaniula nie jest umieszczona zbyt głęboko w aorcie, aby zastawka aortalna i naczynia wieńcowe pozostały wolne.
7. Szybko podłącz kaniulę do aparatu Langendorffa. Upewnij się, że w kaniuli nie pozostały żadne pęcherzyki.
8. Zmień ciśnienie perfuzji na 80 mmHg, umożliwiając perfuzję pod stałym ciśnieniem.
9. Ostrożnie włóż cewnik do prawego przedsionka i prawej komory, nie dotykając ani nie uszkadzając serca, a następnie przymocuj go do kaniuli za pomocą taśmy.
10. Rozpocznij stymulację od przygotowanego cyklu o długości 100 ms przez początkowy 20-minutowy okres równowagi.
11. Zamknij komorę, aby zapewnić stabilną temperaturę.

4. Parametry elektrofizjologiczne i arytmogeneza

1. Zastosuj zaprogramowaną stymulację za pomocą dystalnych lub proksymalnych elektrod cewnika przy dwukrotności progu stymulacji przedsionkowej lub komorowej, aby ocenić parametry elektrofizjologiczne, zgodnie z opisem w poniższych krokach.
   1. Określ czas regeneracji węzła zatokowego jako maksymalną długość cyklu powrotu po 10 s stymulacji o stałej szybkości przy długości cyklu S1S1 wynoszącej 120 ms, 100 ms i 80 ms.
   2. Określ punkt Wenckebacha jako najdłuższą długość cyklu S1S1 (8 bodźców; S1S1: 100 ms; Redukcja skokowa 2 ms) ze stratą 11 przewodzenia węzłowego AV. Określ okresy refrakcji węzłów przedsionkowo-komorowych jako najdłuższe S1S2 (12 bodźców; S1S1: 120 ms, 110 ms i 100 ms; jeden krótki sprzężony bodziec dodatkowy ze stopniową redukcją S1S2 o 2 ms) z utratą przewodnictwa węzłowego przedsionkowo-komorowego.
   3. Określ okresy refrakcji przedsionkowej i komorowej jako najdłuższe S1S2 (12 bodźców; S1S1: 120 ms, 110 ms i 100 ms; jeden krótki sprzężony bodziec dodatkowy ze stopniową redukcją S1S2 o 2 ms) przy braku odpowiedzi przedsionkowej lub komorowej.
2. Wykonaj zaprogramowaną dodatkową stymulację (S1S1: 120 ms, 100 ms i 80 ms, a następnie do 3 dodatkowych uderzeń; 60 - 20 ms ze stopniową redukcją o 2 ms) lub protokoły stymulacji serii (5 s przy S1S1: 50 - 10 ms ze stopniową redukcją o 10 ms) zgodnie z konwencjami Lambeth, aby ocenić arytmogenezę komorową.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S3014		Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	401676	Zmodyfikowane rozwiązanie Krebsa-Henleita
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	P5405		Fosforan potasu monobasic	Sigma-Aldrich	P5655	Zmodyfikowane rozwiązanie Krebsa-Henleita
Siarczan magnezu siedmiowodny	Sigma-Aldrich	M1880	Zmodyfikowane rozwiązanie Krebsa-Henleita
Chlorek wapnia dwuwodny	Sigma-Aldrich	C7902	Zmodyfikowane rozwiązanie Krebsa-Henleita
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767		Pirogronian sodu bioXtra	Sigma-Aldrich	P8574	Zmodyfikowane rozwiązanie Krebsa-Henleita
Carbogen (95% tlenu / 5% dwutlenku węgla)	SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Niemcy		Modified Krebs-Henleit solution
Sterylny filtr steritop-GP 0.22	EMD Millipore	SCGPT05RE	Modified Krebs-Henleit solution
System perfuzji	HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Niemcy	73-4343	Aparat Langendorffa
System akwizycji danych i odpowiednie oprogramowanie do cewnika i parametrów fizjologicznych	Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, Nowa Zelandia	PL3508 PowerLab 8/35	Ustawienia Langendorffa
Octapolar catheter	CIB'ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA	custom	Ustawienia Langendorffa
Generator bodźców	STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Niemcy	STG4002-160μA	Konfiguracja stymulacji
Stimulation software	Multi Channel Systems, Reutlingen, Niemcy	MC_Stimulus II	Konfiguracja stymulacji
Plastic Wrap	Parafilm M, Bemis NA, z siedzibą w Neenah, WI, Stany Zjednoczone		Materiały eksploatacyjne
Spring scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy	15003-08	Przygotowanie serca
Zez Nożyczki	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy	14575-09	Przygotowanie serca
Mayo Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy	14110-15	Przygotowanie serca
Dumont SS Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy	11203-25	Przygotowanie serca
London Kleszcze	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy	11080-02	Przygotowanie serca
Narrow Pattern Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy	11003-13	Przygotowanie serca