Indukcja łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu w modelu mysim

Streszczenie

Źródło: Macheda, T., et. al. Elektromagnetycznie sterowany model zamkniętej głowy łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u myszy. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film demonstruje procedurę wywoływania urazu głowy w modelu myszy przy użyciu klatki stereotaktycznej. Kontrolowane uderzenie replikuje łagodne urazowe uszkodzenie mózgu, umożliwiając naukowcom badanie skutków neurologicznych i powrotu do zdrowia poprzez pomiar odruchów i zachowań po urazie.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Zabieg chirurgiczny

1. Zabezpiecz mysz w ramie stereotaktycznej za pomocą lekkich, zwężających się punktowych prętów nausznych z żywicy acetalowej, pręta do gryzienia i maski do znieczulenia myszy (patrz Rysunek 1G, H). Izofluran jest dostarczany w ilości 2%-3% do powietrza w pomieszczeniu z prędkością 100-200 ml/min. Uważnie monitoruj oddech myszy, aby zapewnić głębokość znieczulenia i w razie potrzeby dostosuj poziom gazu.
2. Nałóż sterylny lubrykant do oczu na oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
3. Trzykrotnie wysterylizuj skórę głowy wacikami z jodonem powidonu i sterylnymi wacikami nasączonymi alkoholem.
4. Upewnij się, że mysz jest głęboko znieczulona, sprawdzając brak reakcji na uszczypnięcie palca.
5. Wykonaj około 1 cm nacięcie w linii środkowej skóry głowy między oczami a szyją za pomocą skalpela, odsłaniając czaszkę (patrz Rysunek 1I).
6. Pozostaw czaszkę do wyschnięcia na 1-2 minuty.
7. Zidentyfikuj bregma (punkt przecięcia szwów czołowych i strzałkowych) i lambda (przecięcie szwów strzałkowych i lambdoidalnych) (patrz Rysunek 1J).
   UWAGA: Atlas mózgu myszy może być użyty jako odniesienie.
8. Umieść aparat podtrzymujący głowę pod głową i napompuj bańkę wodą, aż zacznie naciskać na spód głowy myszy, ale nie odrywa głowy od pręta gryzowego.
   UWAGA: Ten krok jest niezbędny, aby zmniejszyć możliwe problemy z uszami spowodowane urazem zamkniętej głowy (CHI). Każde zwierzę z uszkodzeniem ucha przez pręty uszne, powodujące zwijanie się lub krwawienie, powinno zostać wyeliminowane z badania i poddane eutanazji.
9. Przesuń impaktor na miejsce nad głową zwierzęcia.
10. Wysuń impaktor, umieszczając przełącznik Extend/Retract (na skrzynce kontrolnej impaktora) na Extend.
    UWAGA: Upewnij się, że końcówka jest całkowicie wysunięta, pociągając ją w dół.
11. Ustaw impaktor tak, aż zostanie wyśrodkowany nad bregmą (patrz Rysunek 1K).
12. Zresetuj cyfrowe współrzędne stereotaktyczne x i y w czytniku stereotaktycznym do 0 (na ekranie dotykowym)
13. Ustaw sondę nad miejscem uderzenia, przesuwając sondę z bregmy do współrzędnych docelowych: przyśrodkowo-boczna = 0,0 mm, przednio-tylna = −1,6 mm.
14. Przypnij czujnik kontaktowy do ucha zwierzęcia.
    1. Powoli opuść końcówkę sondy za pomocą przedłużonej sondy, aż do pierwszego kontaktu z powierzchnią. Zatrzymaj się na sygnale dźwiękowym.
    2. Zresetuj cyfrowe współrzędne stereotaktyczne z w czytniku stereotaktycznym do 0.
15. Dokładnie sprawdź, czy końcówka jest zlicowana z czaszką (płaszczyzna przyśrodkowo-boczna i przednio-tylna).
    UWAGA: Ustawienie końcówki sondy jest najważniejszym krokiem tego procesu, aby zapobiec złamaniom czaszki i uszkodzeniu uszu.
16. Wycofaj impaktor, ustawiając przełącznik dwustabilny na skrzynce sterowniczej w pozycji Wycofanie. Końcówka wycofuje się i nie ma już kontaktu z głową zwierzęcia aż do momentu uderzenia.
17. Ustaw głębokość uderzenia, dostosowując głębokość grzbietowo-brzuszną do −1,2 mm.
    UWAGA: Głębokość uderzenia wpływa na stopień urazu. Głębokość powinna być dostosowana do różnych grup wiekowych, wagi i szczepów myszy do pożądanej ciężkości urazu. Głębokość może z czasem wymagać dostosowania/ponownego namiaru, aby utrzymać stałą ciężkość urazu. Nasilenie można ocenić neuropatologicznie: mikroglej i astrocyty (immunohistochemia (IHC)) oraz behawioralnie: labirynt wodny ramienia promieniowego i test aktywnego unikania.
18. Uważnie monitoruj oddech myszy, aby zapewnić głębokość znieczulenia i w razie potrzeby dostosuj poziom gazu.
    UWAGA: Często procent gazu izofluranu powinien być obniżony lub odcięty na 10-20 s przed uderzeniem. Uważnie obserwuj, czy oddech nieznacznie przyspieszy. Jeśli oddychanie jest zbyt wolne w momencie uderzenia, zwierzę może umrzeć w ciągu pierwszych 60 sekund po uderzeniu z powodu bezdechu. Można temu zapobiec, dostosowując głębokość znieczulenia na sekundy przed uderzeniem.
19. Wywołaj uderzenie, naciskając prawy przełącznik na impact. Końcówka sondy opada z wyświetlaną prędkością, a następnie pozostaje w dół przez ustawiony czas przebywania i chowa się.
    UWAGA: Myszy pozorowane są traktowane identycznie jak myszy CHI, ale efekt nie jest dostarczany.
20. Uruchom stoper natychmiast po uderzeniu CHI, aby zarejestrować czasy prostowania (czas powrotu z pozycji bocznej do pozycji leżącej) lub uruchom stoper, gdy mysz zostanie usunięta z ramki stereotaktycznej w przypadku myszy pozorowanych. Średni czas odruchu prostowania wynosi 5-15 minut.
    UWAGA: Czasy odruchu prostowania mogą się różnić w zależności od wysiłku i wieku myszy.
21. Oceń myszy pod kątem widocznych pęknięć czaszki, krwotoków i bezdechu. Z badania należy wykluczyć myszy z wklęsłym złamaniem czaszki lub widocznym krwotokiem.
    UWAGA: Istnieją stopniowane poziomy złamań czaszki. Zwierzęta ze zdekompresowanymi złamaniami czaszki, w których kość obserwujalnie wciska się w tkankę mózgową, są najpierw poddawane eutanazji (CO₂, a jako metodę drugorzędną stosuje się dekapitację). Jeśli końcówka udaru jest prawidłowo ustawiona, tego typu złamania czaszki są niezwykle rzadkie. Jeśli dojdzie do złamania czaszki, częstszym objawem jest niewielka kropla krwi na czaszce i lekkie wyczuwalne w dotyku szorstkowanie czaszki, często wzdłuż szwu łączącego tylny koniec kości nosowej. Myszy te są odnotowywane w dokumentacji jako możliwe złamania czaszki, ale zwykle nie są wykluczane z badania.
22. Usuń zwierzę z ramki stereotaktycznej.
23. Zamknij skórę głowy, zszywając skórę razem.
    UWAGA: Wchłanialne lub niewchłanialne szwy mogą być używane do zamykania skóry głowy jako alternatywa dla zszywek.
24. Nałóż potrójną maść z antybiotykiem za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką na zamknięte nacięcie.
25. Umieść mysz w czystej klatce w celu odzyskania danych. Połowa klatki rekonwalescencji znajduje się na poduszce grzewczej (niskie ustawienie), co zapewnia możliwość odsunięcia się od ciepła po przebudzeniu i utrzymania temperatury zwierzęcia w stanie nieprzytomnym (patrz Rysunek 1L).
    UWAGA: Mysz jest umieszczona na boku w klatce odzyskiwania. Aby zapobiec uduszeniu, umieść zwierzę w klatce ratunkowej bez ściółki lub na chusteczce, jeśli w klatce znajduje się ściółka.
26. Ustaw przełącznik Extend/Retract w pozycji Center/Off .
    UWAGA: Prąd będzie nadal płynął, jeśli przełącznik zostanie pozostawiony w pozycji wysuwania lub cofania, powodując pęcznienie tłoka. Impaktor nie będzie wtedy działał, dopóki tłok nie ostygnie.
27. Wyjmij impaktor z uchwytu i delikatnie umieść go na woreczku z lodem.
    UWAGA: Trzymanie impaktora na opakowaniu z lodu pomaga zmniejszyć potencjalne pęcznienie impaktora.
28. Monitoruj zwierzę do momentu wystąpienia odruchu prostowania i udokumentuj czas do wyprostowania (patrz Rysunek 1M).
    UWAGA: Odruch prostowania jest definiowany jako moment, w którym mysz powraca do pozycji leżącej. Klatkę należy pozostawić w spokoju; Mysz może się poprawić, jeśli klatka zostanie dotknięta, poruszona lub narażona na jakieś dźwięki.
29. Przywróć myszy do ich klatki domowej, gdy nie śpią i są czujne. Zwykle w ciągu 1 godziny po urazie zwierzęta są w pełni przytomne i poruszają się. Dodaj również trochę wilgotnego jedzenia na dno klatki.

Wyniki

Rysunek 1: Krok 1: Konfiguracja obszaru operacyjnego. (A) Pokazano przykład pola operacyjnego i narzędzi potrzebnych do wykonania operacji CHI (okład z lodu do impaktora, rama stereotaktyczna wyposażona w impaktor, skrzynka kontrolna impaktora i narzędzia chirurgiczne). (B) Zbliżenie na stalową końcówkę sondy o średnicy 5 mm, pręt zgryzowy ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
9 mm Autoclip Applier	Braintree scientific	ACS- APL	Chirurgia
9 mm Autoclip Remover	Braintree scientific	ACS- RMV	Chirurgia
9 mm Autoclip, Skrzynka 1,000 klipsów	Braintree scientific	ACS- CS	Chirurgia (zszywki)
Oprogramowanie Aperio ImageScope	Leica BioSystems	NA	IHC
BladeFLASK Blade Remover	Fisher Scientific	22-444-275	Chirurgia
Aplikator z końcówką bawełnianą	VWR	89031-270	Chirurgia
Stereotaktyczna ramka myszy	Stoelting	51730D	Chirurgia
Dumont #7 Kleszcze	Roboz	RS-5047	Chirurgia
Ear bars	Stoelting	51649	Surgery
EthoVision XT 11.0	Noldus Information Technology	NA	RAWM
Fiber-Lite	Dolan-Jeffer Industries	UN16103-DG	Chirurgia
Żarówka Fisherbrand do małych pipet	Fisher Scientific	03-448-21	Aparatura
System unikania Gemini	Instrumenty z San Diego	NA	Aktywne unikanie
Poduszka grzewcza	Sunbeam	732500000U	Przygotowanie
HRP sprzężona koza anty-królicza IgG	Laboratoria Jackson Immuno Research	111-065-144	IHC
Komora indukcyjna	Kent Scientific	VetFlo-0530XS	Przygotowanie
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC: 11695-6777-2	Chirurgia
Głowica do znieczulenia gazem mysim holder	Stoelting	51609M	Chirurgia
Impaktor stereotaktyczny Neuropactor	Narzędzia neurologiczne	n/a	Chirurgia: Formalnie dystrybuowana przez Lecia jako impact one
Mysz NexGen 500	Allentown	n/a	Po operacji, klatka
Parafilm	Bemis	PM992	Aparatura
Peanut - profesjonalna maszynka do strzyżenia włosów	Whal	8655-200	Przygotowanie
Roztwór jodu powidonu USP, 10% (w/v), 1% (w/v) dostępny jod, do laboratorium	Ricca	3955-16	Chirurgia
Puralube Vet Maść, wazelina, sterylny lubrykant do oczu	Dechra	17033-211-38	Chirurgia
Królik anty-GFAP	Dako	Z0334	IHC
Królik anty-IBA1	Wako	019-19741	IHC
8-ramienny radialny labirynt wodny	MazeEngineers	n/a	RAWM
Scale	OHAUS CS series	BAL-101	Przygotowanie
Rękojeść skalpela #7 solidna 6.25"	Roboz	RS-9847	Chirurgia
Sterylne podkładki nasączone alkoholem (alkohol izopropylowy 70% v/v)	Fisher Brand	22-363-750	Przygotowanie
System znieczulenia o niskim przepływie SumnoSuite	Kent Scientific	SS-01	Chirurgia
10 mL strzykawka Luer-Lok Tip	BD Bard-Parker	302995	Aparatura
Timery	Fisher Scientific	6KED8	Chirurgia
Miejscowy krem znieczulający	L.M.X 4	NDC 0496-0882-15	Przygotowanie
Potrójna maść antybiotykowa	Major	NDC 0904-0734-31	Po operacji
Rurka	MasterFlex	96410-16	Aparatura
Jednokanałowy system anestezjologiczny parownika	Kent Scientific	VetFlo-1210S	Przygotowanie do operacji

do podparcia głowy do operacji do operacji do trzymania do podtrzymywania głowy do operacji do operacji do operacji do podparcia głowy do operacji do podparcia głowy