Jednoczesny zapis pletyzmografii i elektromiografii w mysim modelu ALS

Streszczenie

Źródło: Jensen, V. N., i inni. Wielokrotne pomiary aktywności mięśni oddechowych i wentylacji w mysich modelach choroby nerwowo-mięśniowej. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film przedstawia metodę jednoczesnego rejestrowania sygnałów pletyzmografii i elektromiografii w swobodnie poruszającym się modelu myszy ALS. Procedura polega na użyciu wszczepionych elektrod i nadajnika do rejestrowania aktywności mięśni, a także komory pletyzmograficznej do monitorowania wzorców oddychania, w celu zbadania roli mięśni dodatkowych u myszy ALS.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie myszy do operacji

1. Wybierz żądaną mysz do implantacji ( tj. SOD1(G93A) lub kontrolnej) i zważ zwierzę.
   UWAGA: Zalecany wiek i waga myszy (samca lub samicy) poddawanej tej operacji to odpowiednio P56 - P120 i ≥ 24 g.
2. Znieczulij mysz pod wpływem 3,5% izofluranu przy natężeniu przepływu tlenu 2 l/min. Wykonaj szczypanie palców u nóg i ogonów, aby upewnić się, że mysz jest w pełni znieczulona.
3. Po znieczuleniu wyjmij mysz z wrzutnika i utrzymuj znieczulenie za pomocą stożka nosowego, ustawiając poziom izofluranu na 1,5%, a natężenie przepływu tlenu na 1 l/min. Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi i/lub ogona, aby upewnić się, że znieczulenie jest utrzymane.
4. Nałóż lubrykantową maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas zabiegu.
5. Ogol mysz, aby odsłonić miejsce operacji między uchem a ramieniem (Rysunek 1C).
6. Przytnij paznokcie u nóg ipsilateralnie do miejsca operacji, aby zmniejszyć ryzyko wyciągnięcia przewodów przez mysz lub spowodowania ran przez drapanie podczas procesu gojenia.
7. Naprzemiennie pobieraj wymaz z miejsca operowanego, najpierw środkiem dezynfekującym, a następnie izopropanolem. Powtórz jeszcze 2 razy.

2. Wszczepienie urządzenia telemetrycznego w celu rejestrowania aktywności elektromiografii skalnej i czworobocznej (EMG)

1. }Umieść zwierzę pod mikroskopem preparacyjnym, na boku na sterylnej podkładce zakrywającej poduszkę grzewczą i zabezpiecz stożek nosowy taśmą. Należy pamiętać, że najlepiej jest wszczepić implant po prawej stronie, aby zmniejszyć sygnał elektrokardiogramu (EKG) pochodzący z serca.
   UWAGA: Monitoruj oddech i dostosuj poziom izofluranu, jeśli to konieczne, aby utrzymać regularne tempo oddychania i odpowiednią płaszczyznę znieczulenia chirurgicznego.
2. Pociągnij przednią kończynę w kierunku stopy ipsilateralnej wzdłuż tułowia.
   UWAGA: Ta pozycja przesuwa łopatkę doogonowo, zapewniając chirurgiczny dostęp do mięśni pochwy i czworobocznego.
   1. Weź tępe, zakrzywione kleszcze, przytrzymaj przednią łapę ipsilateralnie do pola operacyjnego i przyklej łapę na miejscu (Rysunek 1C). Użyj mocnej samoprzylepnej taśmy chirurgicznej, aby upewnić się, że łapa jest bezpieczna przez cały czas trwania zabiegu.
3. Załóż świeżą parę rękawiczek chirurgicznych. Za pomocą skalpela wykonaj ukośne nacięcie o długości około 2 cm między ramieniem a uchem (czerwona linia na Rysunek 1C).
4. Używając dwóch kleszczyków do laminektomii #2, po jednym w każdej ręce, odciągnij poduszkę tłuszczową i rozsuń mięśnie czworoboczne i platysma, aby odsłonić powięź pokrywającą mięśnie mostkowo-obojczykowo-sutkowe i pochyłe (Rysunek 1D i E).
5. Użyj bladego mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego i nerwu przeponowego jako punktów orientacyjnych, aby zidentyfikować mięśnie pochyłe. Zauważ, że nerw przeponowy biegnie równolegle do mięśni pochyłych,, podczas gdy mostek obojczykowo-obojczykowo-sutkowy leży niżej. Mięśnie pochyłe biegną ukośnie od kręgów szyjnych do żeber pod mięśniem czworobocznym. Przewody biopotencjalne zostaną wprowadzone do mięśnia pochyłego przedniego, który można zidentyfikować jako mięsień biegnący w sąsiedztwie nerwu przeponowego (Rysunek 1F i G).
   UWAGA: Uwaga. Obszar ten jest silnie unaczyniony i należy zachować ostrożność, aby uniknąć przecięcia tętnicy podobojczykowej. Unikaj uszkodzenia nerwu przeponowego i splotu ramiennego.
6. Po zidentyfikowaniu mięśni pochwy i czworobocznego (Ryc. 1G), wykonaj podskórną kieszeń na nadajnik na grzbiecie zwierzęcia, między łopatkami.
   1. Użyj nożyczek do oddzielania tkanek. Włóż tępe końcówki tuż pod skórę i rozprowadź je, aż utworzy się kieszeń o szerokości około 1,25 razy większej niż szerokość nadajnika (Rysunek 1H).
      UWAGA: Nadajnik powinien być włożony z minimalnym oporem, ale kieszeń nie powinna być na tyle duża, aby nadajnik mógł się samodzielnie poruszać. Jeśli kieszeń jest zbyt mała, nadajnik może ocierać się o skórę, powodując podrażnienie, które może skłonić zwierzę do zadrapania skóry i/lub wyciągnięcia przewodu. Jeśli kieszeń jest zbyt duża, mogą powstać surowice lub nadajnik może migrować do niekorzystnej pozycji.
7. Przepłukać ciepłą, sterylną solą fizjologiczną i przyłożyć nadajnik bardziej płaską stroną do mięśnia. Ustaw nadajnik tak, aby leżał płasko, a przewody wychodziły z kieszeni, równolegle do siebie, a nie skręcone (Rysunek 1I). Zwiń nadmiar drutu pod urządzeniem i połóż go płasko.
8. Poprowadź przewody od nadajnika do mięśni pochwy i mięśnia czworobocznego tak, aby dwa zestawy przewodów dwupotencjałowych leżały płasko i równolegle do siebie.
9. Użyj kleszczy do laminektomii, aby oddzielić przednią pochwę od otaczających mięśni i wprowadzić igłę o rozmiarze 25 prostopadłą do włókien mięśniowych przez mięsień pochyły.
   1. Włóż jeden przewód do końcówki igły, a następnie wyciągnij igłę z mięśnia, pozostawiając przewód włożony do mięśnia aż do izolacji drutu (Rysunek 1J i K). Zapisz, które kolorowe przewody są włożone do którego mięśnia.
10. Umieść małą kroplę kleju cyjanoakrylowego na odsłoniętym końcu drutu, blisko mięśnia, w który wkładany jest ołowiany, i szybko nasuń nasadkę ołowianą na drut, tak aby żaden drut nie był odsłonięty między nasadką ołowianą a mięśniem (Rysunek 2A i B).
    UWAGA: Chociaż akceptowaną praktyką jest zabezpieczanie elektrod EMG cyjanoakrylanem, alternatywną metodą jest zawiązanie jedwabnego węzła szwu wokół nasadki ołowianej.
11. Przytnij nadmiar drutu dystalnie do nasadki i nałóż kroplę kleju cyjanoakrylowego na koniec nasadki/drutu ołowianego. Daj klejowi czas na polimeryzację przed uwolnieniem (Rysunek 2C i D).
12. Wykonaj te same kroki (kroki 3.10-3.12), aby włożyć przewód o przeciwnej polaryzacji równolegle do pierwszego w tym samym mięśniu, w odległości 1-2 mm od pierwszego przewodu.
13. Powtórz kroki 3.10 - 3.12, aby wprowadzić przewody do mięśnia czworobocznego, który znajduje się tuż przed mięśniem pochyłym (Rysunki 1L i M).
14. Upewnij się, że przewody są zamocowane na miejscu i że jest wystarczająco dużo luzu, aby zwierzę mogło wykonywać ruchy ciała bez ich ciągnięcia. Upewnij się, że nadmiar smyczy nie naciska na skórę, ponieważ może to spowodować podrażnienie, które może skłonić zwierzę do drapania lub wyciągania smyczy. W razie potrzeby zmień położenie przewodów, aby zapobiec potencjalnemu dyskomfortowi.
15. Delikatnie usuń taśmę przytrzymującą kończynę przednią. Przeciągnij poduszkę tłuszczową z powrotem przez mięsień i użyj jej do zakrycia włożonych przewodów. Zamknij nacięcie klejem cyjanoakrylowym, drażniąc płaty skóry z powrotem do siebie, tak aby nacięcie wyrównało się. Ściśnij część płatów skóry razem z zakrzywionymi kleszczami i nałóż niewielką linię kleju cyjanoakrylowego wzdłuż tej linii.
16. Wstrzyknij podskórnie 0,1 ml karprofenu, aby złagodzić ból pooperacyjny, gdy zwierzę jest jeszcze pod narkozą.
    UWAGA: Kontynuuj podawanie 0,1 ml karprofenu raz dziennie przez 1-2 dni po operacji, a następnie w razie potrzeby.
17. Wyjmij zwierzę z nosa i umieść je w czystej klatce we wstępnie ogrzanym inkubatorze, dopóki nie obudzi się i nie będzie dobrowolnie poruszać się po klatce. Następnie trzymaj zwierzę w inkubatorze przez co najmniej 15 minut, monitorując jego ruchy i czujność.

3. Opieka pooperacyjna

1. Zwierzęta domowe oddzielnie po operacji. Zaopatrz leczące zwierzęta w żel dietetyczny i butelkę z wodą.
2. Monitoruj zwierzę przez pierwsze 30 minut po zabiegu. Sprawdzaj zwierzę co najmniej co godzinę przez 5 godzin po zabiegu. W ciągu kilku dni po zabiegu należy przeprowadzać badania kontrolne co najmniej dwa razy dziennie.
3. Uważaj na martwicę, infekcję wzdłuż nacięcia i w jamie ciała, w której znajduje się implant (tj. ciepło, obrzęk i zaczerwienienie) oraz tworzenie się surowicy.
   UWAGA: Te objawy pojawiają się w ciągu pierwszego tygodnia po operacji. Rysunek 1N pokazuje zdrowe, wyleczone zwierzę miesiąc po operacji. Chociaż zapisy EMG można wykonać natychmiast po implantacji, zwierzęta mają co najmniej tydzień na wygojenie się przed zapisaniem EMG i pletyzmografii, ponieważ sygnały EKG mogą być wysokie bezpośrednio po implantacji.

4. Odbieranie jednoczesnych sygnałów elektromiografii i pletyzmografii

1. Włącz wszystkie urządzenia do akwizycji, w tym przepływ odchylenia.
   UWAGA: Szybkość przepływu dla myszy jest zwykle ustawiona na 1,0 l/min.
2. Skalibruj komorę (komory) pletyzmograficzną za pomocą przepływomierza.
   UWAGA: Okresowo sprawdzaj komory pletyzmografii, aby upewnić się, że uszczelki nie są pęknięte lub uszkodzone. Aby utrzymać ich dobry stan, raz w tygodniu pokrywaj gumowe uszczelki smarem, takim jak smar próżniowy.
3. Kalibracja przetwornika wejściowego zgodnie ze specyfikacją producenta.
4. Umieść mysz w komorze pletyzmografii na co najmniej 1 godzinę, aby się zaaklimatyzowała przed zapisaniem EMG i pletyzmografii. Korzystając z wielu komór, możliwe jest nagrywanie z jednej myszy, podczas gdy następna mysz aklimatyzuje się w drugiej komorze. Nie włączaj nadajnika w okresie aklimatyzacji, aby oszczędzać energię baterii (Rysunek 1O).
5. Przed nagrywaniem (ale po kalibracji) włącz nadajnik, umieszczając silny magnes w odległości 1 cala od wszczepionego zwierzęcia; Czerwona lampka z przodu odbiornika wskaże, kiedy nadajnik jest włączony.
6. Rozpocznij akwizycję za pomocą menu rozwijanego oznaczonego "Akwizycja" i wybierz "Rozpocznij akwizycję". Chociaż czas nagrywania może się różnić w zależności od eksperymentu, typowy zapis pletyzmografii i EMG trwa 1 - 3 godziny.
   UWAGA: Nadajnik ma wewnętrzną częstotliwość próbkowania 240 Hz. W oprogramowaniu ustawiana jest szybsza częstotliwość 500 Hz, aby interpolować między punktami i zapewnić płynniejszy przebieg. Filtr dolnoprzepustowy (który służy jako filtr antyaliasingowy) i filtr górnoprzepustowy w implantie określają szerokość pasma od 1 do 50 Hz dla tego urządzenia telemetrycznego. Zakłócenia klimatyzacji 60 Hz nie przyczyniają się do nadmiernych zakłóceń w sygnale EMG, ponieważ implanty są zasilane bateryjnie, a zwierzę osłania implant i przewodzi przed polami elektrycznymi. Pletyzmografia, EMG i wideo są automatycznie synchronizowane w czasie rzeczywistym za pomocą oprogramowania do akwizycji.
7. Po zakończeniu akwizycji wyłącz nadajnik za pomocą magnesu i wyjmij zwierzę z komory.

Wyniki

Rysunek 1. Implantacja urządzenia telemetrycznego do pomiaru EMG mięśni oddechowych. (A) Nadajniki telemetryczne z dwiema parami biopotencjału prowadzą do pomiaru EMG. Przewody można przyciąć do ż...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
B6.Cg-Tg (SOD1*G93A)1 Gur/J	Laboratorium Jacksona	4435
Komora Pletyzmograficzna	Buxco Respiratory Products/ Data Sciences International	601-1425-001
Odbiorniki telemetryczne (model RPC-1)	Data Sciences International	272-6001-001
Pompa przepływowa polaryzacyjna (model BFL0500)	Data Sciences International	601-2201-001
ACQ-7000 USB	Data Sciences International	PNM-P3P-7002XS
Dataquest A.R.T. Data Exchange Matrix	Data Sciences International	271-0117-001
New Ponemah Analysis System	Data Sciences International	PNM-POST-CFG
Ponemah Physiology Platform Acqusition software v5.20	Dane Sciences International	PNM-P3P-520
Ponemah Unrestrained Whole Breath Pakiet analiz pletyzmografii v5.20	Data Sciences International	PNM-URP100W
Skonfigurowany system oprogramowania Ponemah	Data Sciences International	PNM-P3P-CFG
Analysis Module (URP)	Data Sciences International	PNM-URP100W
Wzmacniacz uniwersalny	Data Sciences International	13-7715-59
Sync Board	Data Sciences International	271-0401-001
Kabel synchronizacyjny	Data Sciences International	274-0030-001
Transducer-Pressure Buxco	Data Sciences International	600-1114-001
Przepływomierz	Data Sciences International	600-1260-001
Magnes i radio w zestawie startowym F20-EET	Data Sciences International	276-0400-001
Axis P1363 Video Camera	Data Sciences International	275-0201-001
Terg-A-Zyme	Fisher Scientific	50-821-785	Detergent
Actril	Minntech Corporation	78337-000	Chemiczny środek sterylizacyjny
Stereoskopowy mikroskop preparacyjny (model MEB126)	Leica	10-450-508
Nawilżacz/inkubator dla niemowląt	OHMEDA Ohio Care Plus	6600-0506-803
Nadajniki TL11M2-F20-EET	Międzynarodowe nauki o danych	270-0124-001
Kleszcze do laminektomii Dumont #2 - końcówki standardowe/proste/12cm (x2)	Fine Scientific Instruments	11223-20	Do obsługi przewodów
Kleszcze do laminektomii Dumont #2 - Końcówki standardowe/Proste/12cm (x2)	Fine Scientific Instruments	11223-20	Do chirurgii
Kleszczyki wąskowzór- ząbkowane/zakrzywione/12cm	Fine Scientific Instruments	17003-12
Spring - Tough Cut/Straight/Sharp/12.5cm/6mm Krawędź tnąca	Fine Scientific Instruments	15124-12
Nożyczki do separacji tkanek - proste/tępe-tępe/11.5cm	Instrumenty naukowe	14072-10
Cienkie nożyczki - Twarde cięcie/Zakrzywione/Ostre-ostre/9 cm	Fine Scientific Instruments	14058-11	Do cięcia drutów i obcinania paznokci
Rękojeść skalpela #3	World Precision Instruments	500236
Ostrze skalpela	Instrumenty naukowe	10010-00	Do przygotowania czapek
Polysorb Pleciony szew wchłanialny	Coviden	D4G1532X	Do zwijania przewodów nadajnika
Gluture	Zoetis Inc.	6606-65-1	Klej cyjanoakrylowy
3 mL końcówka strzykawkowa - miękka	Vitality Medical	118030055		Igła 25G (x2)	Becton Dickinson and Co.
305-145
Aplikatory z bawełnianą końcówką	Henry Schein Animal Health	100-9175
Zestaw maszynek do strzyżenia włosów Andis Easy Cut	049-06-0271	Elektryczna maszynka do golenia sprzedawana w Target
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	29404	Anesthetic
Alkohol izopropylowy 70%	Priority Care 1	MS070PC
Dermachlor 2% Medical Scrub ( chloroheksydyna 2%)	Butler Schein	55482
Sztuczne łzy	Henry Schein Animal Health	48272	Maść
Smar próżniowy	Dow Corning Corporation	1597418
Koc wodny	JorVet	JOR784BN

enzymatyczny ołowianych okulistyczna lubrykantowa