Jednoczesny zapis pletyzmografii i elektromiografii w mysim modelu ALS

Streszczenie

Źródło: Jensen, V. N., i inni. Wielokrotne pomiary aktywności mięśni oddechowych i wentylacji w mysich modelach choroby nerwowo-mięśniowej. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film przedstawia metodę jednoczesnego rejestrowania sygnałów pletyzmografii i elektromiografii w swobodnie poruszającym się modelu myszy ALS. Procedura polega na użyciu wszczepionych elektrod i nadajnika do rejestrowania aktywności mięśni, a także komory pletyzmograficznej do monitorowania wzorców oddychania, w celu zbadania roli mięśni dodatkowych u myszy ALS.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie myszy do operacji

1. Wybierz żądaną mysz do implantacji ( tj. SOD1(G93A) lub kontrolnej) i zważ zwierzę.
   UWAGA: Zalecany wiek i waga myszy (samca lub samicy) poddawanej tej operacji to odpowiednio P56 - P120 i ≥ 24 g.
2. Znieczulij mysz pod wpływem 3,5% izofluranu przy natężeniu przepływu tlenu 2 l/min. Wykonaj szczypanie palców u nóg i ogonów, aby upewnić się, że mysz jest w pełni znieczulona.
3. Po znieczuleniu wyjmij mysz z wrzutnika i utrzymuj znieczulenie za pomocą stożka nosowego, ustawiając poziom izofluranu na 1,5%, a natężenie przepływu tlenu na 1 l/min. Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi i/lub ogona, aby upewnić się, że znieczulenie jest utrzymane.
4. Nałóż lubrykantową maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas zabiegu.
5. Ogol mysz, aby odsłonić miejsce operacji między uchem a ramieniem (Rysunek 1C).
6. Przytnij paznokcie u nóg ipsilateralnie do miejsca operacji, aby zmniejszyć ryzyko wyciągnięcia przewodów przez mysz lub spowodowania ran przez drapanie podczas procesu gojenia.
7. Naprzemiennie pobieraj wymaz z miejsca operowanego, najpierw środkiem dezynfekującym, a następnie izopropanolem. Powtórz jeszcze 2 razy.

2. Wszczepienie urządzenia telemetrycznego w celu rejestrowania aktywności elektromiografii skalnej i czworobocznej (EMG)

1. }Umieść zwierzę pod mikroskopem preparacyjnym, na boku na sterylnej podkładce zakrywającej poduszkę grzewczą i zabezpiecz stożek nosowy taśmą. Należy pamiętać, że najlepiej jest wszczepić implant po prawej stronie, aby zmniejszyć sygnał elektrokardiogramu (EKG) pochodzący z serca.
   UWAGA: Monitoruj oddech i dostosuj poziom izofluranu, jeśli to konieczne, aby utrzymać regularne tempo oddychania i odpowiednią płaszczyznę znieczulenia chirurgicznego.
2. Pociągnij przednią kończynę w kierunku stopy ipsilateralnej wzdłuż tułowia.
   UWAGA: Ta pozycja przesuwa łopatkę doogonowo, zapewniając chirurgiczny dostęp do mięśni pochwy i czworobocznego.
   1. Weź tępe, zakrzywione kleszcze, przytrzymaj przednią łapę ipsilateralnie do pola operacyjnego i przyklej łapę na miejscu (Rysunek 1C). Użyj mocnej samoprzylepnej taśmy chirurgicznej, aby upewnić się, że łapa jest bezpieczna przez cały czas trwania zabiegu.
3. Załóż świeżą parę rękawiczek chirurgicznych. Za pomocą skalpela wykonaj ukośne nacięcie o długości około 2 cm między ramieniem a uchem (czerwona linia na Rysunek 1C).
4. Używając dwóch kleszczyków do laminektomii #2, po jednym w każdej ręce, odciągnij poduszkę tłuszczową i rozsuń mięśnie czworoboczne i platysma, aby odsłonić powięź pokrywającą mięśnie mostkowo-obojczykowo-sutkowe i pochyłe (Rysunek 1D i E).
5. Użyj bladego mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego i nerwu przeponowego jako punktów orientacyjnych, aby zidentyfikować mięśnie pochyłe. Zauważ, że nerw przeponowy biegnie równolegle do mięśni pochyłych,, podczas gdy mostek obojczykowo-obojczykowo-sutkowy leży niżej. Mięśnie pochyłe biegną ukośnie od kręgów szyjnych do żeber pod mięśniem czworobocznym. Przewody biopotencjalne zostaną wprowadzone do mięśnia pochyłego przedniego, który można zidentyfikować jako mięsień biegnący w sąsiedztwie nerwu przeponowego (Rysunek 1F i G).
   UWAGA: Uwaga. Obszar ten jest silnie unaczyniony i należy zachować ostrożność, aby uniknąć przecięcia tętnicy podobojczykowej. Unikaj uszkodzenia nerwu przeponowego i splotu ramiennego.
6. Po zidentyfikowaniu mięśni pochwy i czworobocznego (Ryc. 1G), wykonaj podskórną kieszeń na nadajnik na grzbiecie zwierzęcia, między łopatkami.
   1. Użyj nożyczek do oddzielania tkanek. Włóż tępe końcówki tuż pod skórę i rozprowadź je, aż utworzy się kieszeń o szerokości około 1,25 razy większej niż szerokość nadajnika (Rysunek 1H).
      UWAGA: Nadajnik powinien być włożony z minimalnym oporem, ale kieszeń nie powinna być na tyle duża, aby nadajnik mógł się samodzielnie poruszać. Jeśli kieszeń jest zbyt mała, nadajnik może ocierać się o skórę, powodując podrażnienie, które może skłonić zwierzę do zadrapania skóry i/lub wyciągnięcia przewodu. Jeśli kieszeń jest zbyt duża, mogą powstać surowice lub nadajnik może migrować do niekorzystnej pozycji.
7. Przepłukać ciepłą, sterylną solą fizjologiczną i przyłożyć nadajnik bardziej płaską stroną do mięśnia. Ustaw nadajnik tak, aby leżał płasko, a przewody wychodziły z kieszeni, równolegle do siebie, a nie skręcone (Rysunek 1I). Zwiń nadmiar drutu pod urządzeniem i połóż go płasko.
8. Poprowadź przewody od nadajnika do mięśni pochwy i mięśnia czworobocznego tak, aby dwa zestawy przewodów dwupotencjałowych leżały płasko i równolegle do siebie.
9. Użyj kleszczy do laminektomii, aby oddzielić przednią pochwę od otaczających mięśni i wprowadzić igłę o rozmiarze 25 prostopadłą do włókien mięśniowych przez mięsień pochyły.
   1. Włóż jeden przewód do końcówki igły, a następnie wyciągnij igłę z mięśnia, pozostawiając przewód włożony do mięśnia aż do izolacji drutu (Rysunek 1J i K). Zapisz, które kolorowe przewody są włożone do którego mięśnia.
10. Umieść małą kroplę kleju cyjanoakrylowego na odsłoniętym końcu drutu, blisko mięśnia, w który wkładany jest ołowiany, i szybko nasuń nasadkę ołowianą na drut, tak aby żaden drut nie był odsłonięty między nasadką ołowianą a mięśniem (Rysunek 2A i B).
    UWAGA: Chociaż akceptowaną praktyką jest zabezpieczanie elektrod EMG cyjanoakrylanem, alternatywną metodą jest zawiązanie jedwabnego węzła szwu wokół nasadki ołowianej.
11. Przytnij nadmiar drutu dystalnie do nasadki i nałóż kroplę kleju cyjanoakrylowego na koniec nasadki/drutu ołowianego. Daj klejowi czas na polimeryzację przed uwolnieniem (Rysunek 2C i D).
12. Wykonaj te same kroki (kroki 3.10-3.12), aby włożyć przewód o przeciwnej polaryzacji równolegle do pierwszego w tym samym mięśniu, w odległości 1-2 mm od pierwszego przewodu.
13. Powtórz kroki 3.10 - 3.12, aby wprowadzić przewody do mięśnia czworobocznego, który znajduje się tuż przed mięśniem pochyłym (Rysunki 1L i M).
14. Upewnij się, że przewody są zamocowane na miejscu i że jest wystarczająco dużo luzu, aby zwierzę mogło wykonywać ruchy ciała bez ich ciągnięcia. Upewnij się, że nadmiar smyczy nie naciska na skórę, ponieważ może to spowodować podrażnienie, które może skłonić zwierzę do drapania lub wyciągania smyczy. W razie potrzeby zmień położenie przewodów, aby zapobiec potencjalnemu dyskomfortowi.
15. Delikatnie usuń taśmę przytrzymującą kończynę przednią. Przeciągnij poduszkę tłuszczową z powrotem przez mięsień i użyj jej do zakrycia włożonych przewodów. Zamknij nacięcie klejem cyjanoakrylowym, drażniąc płaty skóry z powrotem do siebie, tak aby nacięcie wyrównało się. Ściśnij część płatów skóry razem z zakrzywionymi kleszczami i nałóż niewielką linię kleju cyjanoakrylowego wzdłuż tej linii.
16. Wstrzyknij podskórnie 0,1 ml karprofenu, aby złagodzić ból pooperacyjny, gdy zwierzę jest jeszcze pod narkozą.
    UWAGA: Kontynuuj podawanie 0,1 ml karprofenu raz dziennie przez 1-2 dni po operacji, a następnie w razie potrzeby.
17. Wyjmij zwierzę z nosa i umieść je w czystej klatce we wstępnie ogrzanym inkubatorze, dopóki nie obudzi się i nie będzie dobrowolnie poruszać się po klatce. Następnie trzymaj zwierzę w inkubatorze przez co najmniej 15 minut, monitorując jego ruchy i czujność.

3. Opieka pooperacyjna

1. Zwierzęta domowe oddzielnie po operacji. Zaopatrz leczące zwierzęta w żel dietetyczny i butelkę z wodą.
2. Monitoruj zwierzę przez pierwsze 30 minut po zabiegu. Sprawdzaj zwierzę co najmniej co godzinę przez 5 godzin po zabiegu. W ciągu kilku dni po zabiegu należy przeprowadzać badania kontrolne co najmniej dwa razy dziennie.
3. Uważaj na martwicę, infekcję wzdłuż nacięcia i w jamie ciała, w której znajduje się implant (tj. ciepło, obrzęk i zaczerwienienie) oraz tworzenie się surowicy.
   UWAGA: Te objawy pojawiają się w ciągu pierwszego tygodnia po operacji. Rysunek 1N pokazuje zdrowe, wyleczone zwierzę miesiąc po operacji. Chociaż zapisy EMG można wykonać natychmiast po implantacji, zwierzęta mają co najmniej tydzień na wygojenie się przed zapisaniem EMG i pletyzmografii, ponieważ sygnały EKG mogą być wysokie bezpośrednio po implantacji.

4. Odbieranie jednoczesnych sygnałów elektromiografii i pletyzmografii

1. Włącz wszystkie urządzenia do akwizycji, w tym przepływ odchylenia.
   UWAGA: Szybkość przepływu dla myszy jest zwykle ustawiona na 1,0 l/min.
2. Skalibruj komorę (komory) pletyzmograficzną za pomocą przepływomierza.
   UWAGA: Okresowo sprawdzaj komory pletyzmografii, aby upewnić się, że uszczelki nie są pęknięte lub uszkodzone. Aby utrzymać ich dobry stan, raz w tygodniu pokrywaj gumowe uszczelki smarem, takim jak smar próżniowy.
3. Kalibracja przetwornika wejściowego zgodnie ze specyfikacją producenta.
4. Umieść mysz w komorze pletyzmografii na co najmniej 1 godzinę, aby się zaaklimatyzowała przed zapisaniem EMG i pletyzmografii. Korzystając z wielu komór, możliwe jest nagrywanie z jednej myszy, podczas gdy następna mysz aklimatyzuje się w drugiej komorze. Nie włączaj nadajnika w okresie aklimatyzacji, aby oszczędzać energię baterii (Rysunek 1O).
5. Przed nagrywaniem (ale po kalibracji) włącz nadajnik, umieszczając silny magnes w odległości 1 cala od wszczepionego zwierzęcia; Czerwona lampka z przodu odbiornika wskaże, kiedy nadajnik jest włączony.
6. Rozpocznij akwizycję za pomocą menu rozwijanego oznaczonego "Akwizycja" i wybierz "Rozpocznij akwizycję". Chociaż czas nagrywania może się różnić w zależności od eksperymentu, typowy zapis pletyzmografii i EMG trwa 1 - 3 godziny.
   UWAGA: Nadajnik ma wewnętrzną częstotliwość próbkowania 240 Hz. W oprogramowaniu ustawiana jest szybsza częstotliwość 500 Hz, aby interpolować między punktami i zapewnić płynniejszy przebieg. Filtr dolnoprzepustowy (który służy jako filtr antyaliasingowy) i filtr górnoprzepustowy w implantie określają szerokość pasma od 1 do 50 Hz dla tego urządzenia telemetrycznego. Zakłócenia klimatyzacji 60 Hz nie przyczyniają się do nadmiernych zakłóceń w sygnale EMG, ponieważ implanty są zasilane bateryjnie, a zwierzę osłania implant i przewodzi przed polami elektrycznymi. Pletyzmografia, EMG i wideo są automatycznie synchronizowane w czasie rzeczywistym za pomocą oprogramowania do akwizycji.
7. Po zakończeniu akwizycji wyłącz nadajnik za pomocą magnesu i wyjmij zwierzę z komory.

Wyniki

Rysunek 1. Implantacja urządzenia telemetrycznego do pomiaru EMG mięśni oddechowych. (A) Nadajniki telemetryczne z dwiema parami biopotencjału prowadzą do pomiaru EMG. Przewody można przyciąć do ż...

Materiały