Wywoływanie masywnego krwotoku pontyńskiego w modelu szczurzym za pomocą autologicznego wstrzyknięcia krwi

Streszczenie

Źródło: Tang, X. et. al., Masywny krwotok z mostu przez podwójne wstrzyknięcie krwi autologicznej. J. Vis. Exp. (2021)

Ten protokół opisuje kontrolowaną infuzję autologicznej krwi do obszaru mostu mózgu szczura w celu modelowania masywnego krwotoku mostowego. Celem jest symulacja miejscowego krwawienia do mózgu poprzez zwiększenie miejscowego ciśnienia.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Animal and instruments
2. Użyj 8-tygodniowego samca szczura Sprague-Dawley o wadze 250 ± 10 g.
3. Trzymaj szczury przez co najmniej 7 dni przed operacją w kontrolowanych warunkach środowiskowych z temperaturą otoczenia 25 °C, wilgotnością względną 65% i cyklem 12/12 godzin jasny-ciemny.
4. Zapewnij jedzenie i wodę bez ograniczeń.
5. Przygotuj instrumenty (Rysunek 1A-E).

2. Wstrzyknij krew do pons

1. Zważ szczury ponownie 3 dni przed operacją, aby wybrać szczury o odpowiedniej masie ciała do eksperymentów.
2. W ciągu 3 dni poprzedzających modelowanie, trenuj szczury, aby chodziły po równoważni 3 razy dziennie, aby upewnić się, że normalne szczury mogą przejść przez równoważnię bez przerwy.
3. Rozgrzej poduszkę grzewczą do 37 °C przed znieczuleniem.
4. Przymocuj mikrowiertło do uchwytu na ramie stereotaktycznej.
5. Wstrzyknąć szczurom 50 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny dootrzewnowo. Poczekaj, aż nie będzie reakcji na uszczypnięcie palca.
6. Przenieś szczura do ramy stereotaktycznej w pozycji leżącej. Umieść listwy nauszne nad kanałem słuchowym, aby zabezpieczyć głowę. Zamocować czaszkę w pozycji poziomej, aby uniknąć przekrzywienia wstrzyknięcia (Rycina 1F).
7. Utrzymuj znieczulenie za pomocą izofluranu (97,5% tlenu i 2,5% izofluranu) przez stereotaktyczny stożek nosowy z portem wlotowym i wylotowym.
8. Użyj maści do oczu, aby utrzymać wilgotność rogówki.
9. Zgol włosy nad czaszką za pomocą mikrogolarki.
10. Narysuj markerem 3 cm linię środkową w czaszce od linii obustronnego bocznego canthus do 0,5 cm za tylnym ciemiączkiem, jak pokazano na rysunku 1F.
11. Nakładaj peeling chirurgiczny Entoiod w okrężny sposób, zaczynając od środka zaznaczonej linii środkowej i obracając na zewnątrz.
12. Umieść serwetę chirurgiczną.
13. Wykonaj nacięcie skalpelem wzdłuż zaznaczonej linii środkowej.
14. Użyj bawełnianego wacika, aby usunąć potencjalną krew.
15. Umieść kawałek kleszczy po każdej stronie płata skóry głowy, aby odsłonić czaszkę (Rysunek 1G).
16. Zanurz bawełniany wacik w 0,9% soli fizjologicznej i delikatnie usuń tkankę łączną z kości czaszki, aby uniknąć zaplątania się tkanki łącznej w mikrowiertło.
17. Zaznacz centralny punkt bregmy jako punkt początkowy za pomocą markera.
18. Wykonaj kraniotomię (1 mm średnicy) za pomocą mikrowiertła na AP-9.0 mm, Lat 0 mm (Rysunek 2B i Tabela 1). Postępuj ostrożnie, ponieważ ten punkt znajduje się bardzo blisko zatoki żylnej (ryc. 1G).
19. Usuń mikrowiertło z ramki stereotaktycznej.
20. Umieść strzykawkę Hamiltona o pojemności 100 μl w uchwycie stereotaktycznym (Rysunek 1K). Włącz przełącznik pompy wtryskowej, kliknij przycisk szybkiej inhalacji, odessać roztwór heparyny (12500 j. rozcieńczony w 100 ml soli fizjologicznej) do 100 μl, a następnie całkowicie go opróżnić, aby zapobiec zbyt szybkiemu krzepnięciu krwi.
21. Nałóż chlorheksydynę i 75% alkoholowy peeling chirurgiczny na cały ogon od nasady aż po końce co najmniej 3 razy, aby zdezynfekować skórę, złagodzić rogowacenie i rozszerzyć żyłę ogonową, aby zwiększyć wskaźnik powodzenia wstrzyknięcia.
22. Podłącz akupunkturę skóry głowy do strzykawki o pojemności 1 ml.
23. Wprowadzić akupunkturę skóry głowy do bocznej żyły ogonowej w odległości 3 cm od końcówki ogona i pobrać 150 μL krwi (Rysunek 1H).
24. Usuń akupunkturę skóry głowy ze strzykawki o pojemności 1 ml.
25. Przenieś krew do probówki (Rysunek 1I).
    UWAGA: Przenieś szybko, aby zapobiec krzepnięciu krwi.
26. Zmień rękawice chirurgiczne.
27. Wybierz tryb wypłaty, ustaw głośność na 100 μL, ustaw prędkość na 200 μL/min, kliknij przycisk RUN i odessaj 100 μL krwi do strzykawki Hamilton (Rysunek 1J).
28. Wybierz tryb zaparzania i ustaw prędkość na 1 μL/min.
29. Przesuwaj strzykawkę, aż końcówka osiągnie 9,2 mm poniżej powierzchni mózgu (Rysunek 2C i Rysunek 1L).
30. Kliknij przycisk Uruchom, aby wstrzyknąć pierwsze 10 μL krwi z prędkością 1 μL/min (Tabela 1).
31. Przerwać wstrzyknięcie i pozostawić strzykawkę na miejscu przez 20 minut, aby zapobiec napływowi krwi do przestrzeni podpajęczynówkowej.
32. Wycofaj strzykawkę, aż końcówka znajdzie się na głębokości 9,0 mm pod powierzchnią mózgu.
33. Wznowić wstrzyknięcie z tą samą prędkością 1 μL/min, aż do całkowitego wstrzyknięcia resztkowej krwi.
34. Pozostaw strzykawkę na miejscu na 10 minut, aby uniknąć cofania się krwi.
35. Powoli wyjmij strzykawkę z mózgu.
36. Użyj cementu kostnego, aby zakryć otwór kraniotomijny.
37. Gdy cement wyschnie, zszyj ranę włóknem poliamidowym 4-0. Po uszyciu 3 lub 4 ściegów zawiąż 2-1-1 standardowe węzły chirurgiczne.
38. Aby zapobiec infekcji, wstrzyknij szczurowi penicylinę (0,25 ml, 80 j.m. rozcieńczoną w 4 ml soli fizjologicznej) dootrzewnowo.
39. Wstrzyknąć szczurom podskórnie winian butorfanolu (2,5 mg/kg) i powtarzać wstrzyknięcie co 2 godziny, aby złagodzić ból pooperacyjny do 24 godzin po operacji.
40. Obserwuj szczura co 15 minut, aż w pełni wyzdrowieje po znieczuleniu. Umieść go z powrotem w oryginalnej klatce, z poduszką grzewczą pod klatką. Zapewnij szczurowi swobodny dostęp do jedzenia i wody do czasu złożenia ofiary.

Tabela 1: Wstrzyknięcie krwi autologicznej.

Mild

Lat: lateral

	Moderate	Masywny
Całkowita objętość	< span style='kolor tła: przezroczysty; kolor:#1a202c;'>30 μL	60 μL	< span style='kolor tła: przezroczysty; kolor:#1a202c;'>100 μL
Pierwsze wstrzyknięcie
Współrzędne stereotaktyczne	< span style='kolor tła:przezroczysty; kolor:#1a202c;'>AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm
Volume	10 μL	10 μL	10 μL
Prędkość	1 μL/min	1 μL/min	1 μL/min
< span style='kolor tła: przezroczysty; kolor:#1a202c;'>Czas interwału	20 min	20 min	20 min
Second injection
Współrzędne stereotaktyczne	AP -9.0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm		AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9.0 mm
Volume	20 μL	50 μL	90 μL
Prędkość	1 μL/min	1 μL/min	1 μL/min
Przed wyjęciem igły	10 min	10 min	10 min
AP: pozycja przednio-tylna
Vert: vertical

< td style='background-color:#ffffff;border:0.625pt solid #1a202c;padding:4pt 2pt;vertical-align:top;'>< td style='kolor tła:#ffffff;obramowanie:0,625 pkt jednolite #1a202c;wypełnienie:4 pkt 2 punkty; wyrównanie w pionie:góra; '> < td style='kolor tła:#ffffff;obramowanie:0,625 pkt #1a202c jednolite; wypełnienie:4 pkt 2 pkt w pionie; > < style ='border:0,625pt solid #1a202c;padding:4pt 2pt;vertical-align:top;'>

Wyniki

Rycina 1: Narzędzia i procedura chirurgiczna. (A) Maszyna do znieczulenia. (B) Narzędzia chirurgiczne. (C) Mikrowiertło. (D) Pompa mikrowtryskowa. (E) Aparatura stereotaktyczna. (F) Na środku czaszki zaznaczona jest linia. (G) Żółta strzałka wskazuje miejsce wiercenia. (H) Drenaż krwi z żyły ogonowej. (I) Przenieść krew do probówki...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
100ml roztwór soli fizjologicznej	Guangdong yixiang	191222201 C1	Przygotowanie rozcieńczalnika
100μl Microinjector	Shanghai Gaoge		Wstrzyknięcie autologicznej krwi
1ml Syringe	Jiangsu Zhiyu	20191014	Wycofaj autologiczną krew z żyły
75% Alcohol	Shandong Lierkang		Dezynfekcja ogona
Taśma klejąca	Shanghai Jinzhong		Surgicl instruments
System znieczulenia zwierząt	RWD	Wywoływanie i utrzymywanie znieczulenia
Balance beam	Jiangsu Saiangsi		Dla wyników deficytu neurologicznego
Bone cement	Shanghai Xinshiji	20180306	Instrumenty
Butorphanol tartrate	Jiangsu Hengrui		Do leczenia bólu
Elektryczna wiertarka czaszkowa	Nanjing Darwin biotechnology	20180090018	Robienie otworu na żarna na czaszce
EP tube	Nantong Surui		Przenieś autologiczną krew
Krem pod oczy Erytromycyna	Yunnan pharmacy		Ochrona oczu
Poduszka grzewcza	Dangerous Jungle	JR01	Keeping warm
Wstrzyknięcie heparyny sodu	Chengdu Haitong Pharmacal Company	190701	Przygotowanie rozcieńczalnika
IndoPhors	Guoyao z Chin		Sterylizacja
Isoflurane	RWD	20080701	Wywoływanie i utrzymywanie znieczulenia
Pompa do mikrowtrysków	Baoding Leifu	TFD03-01-C	Wstrzyknięcie autologicznej krwi
Uchwyt na igłę	Shanghai Jinzhong	J32020	Surgicl instruments
Penicilin	Guoyao of China		Infection Prevention
Q-tips	Jiangxi Songhe		Surgicl instruments
Igła do skóry głowy	20200313	Wycofaj autologiczną krew z żyły
Scalpel	Shanghai Kaiyuan	170902	Surgicl instruments
Nożyczki do strzyżenia	Shanghai Jinzhong	Y00040	Instrumenty
Aparat stereotaktyczny	RWD	900-00001-00	Do pozycjonowania
Ręcznik chirurgiczny	Xinxiang Huakangweicai	20070601	Surgicl instruments
Igła do szwów	Shanghai Jinzhong		Surgicl instruments
Nożyczki do szwów	Shanghai Jinzhong	J25041	Surgicl instruments
Kleszcze do trzymania tkanek	Shanghai Jinzhong	J31080	Instrumenty chirurgiczne

heparyny ogonowej szczurachirurgiczneheparyny ogonowej chirurgiczne chirurgicznego