$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Montaż okularów dla myszy
- Przygotuj części potrzebne do montażu okularów (Rysunek 1a). Do każdej myszy przygotuj wszystkie elementy: jeden nylonowy kij montowany na głowie, jedną wyższą i jedną niższą tytanową ramkę, dwie soczewki o odpowiednich mocach w zależności od celu eksperymentu, jedną śrubę w rozmiarze M1.4 o długości 10 mm, jedną nakrętkę pod śrubę w rozmiarze M1.4, jedną podkładkę gładką pod śrubę w rozmiarze M1.4 o grubości 0,3 mm, i dwie sztuczne końcówki paznokci. UWAGA: Istnieją dwa rodzaje ramek o różnych wysokościach. W przypadku jednej myszy jako zestaw używana jest jedna wyższa ramka i jedna dolna ramka. Wyższe oprawki powinny być umieszczone nad dolnymi, aby pola widzenia były symetryczne. Oprawki i soczewki są specjalnie zaprojektowane i wyprodukowane przez grupę badawczą autorów. Można je uzyskać, kontaktując się z autorami korespondencyjnymi tego artykułu. Inne części można znaleźć w detalicznych sklepach z narzędziami.
- Zamontuj oprawkę na prawe i lewe oko osobno.
- Ułóż końcówkę paznokcia tak, aby była skierowana na zewnątrz, aby uzyskać najlepszy efekt ochronny. Dostosuj kąt między czubkiem paznokcia a ramką tak, aby wynosił około 130°, aby uniknąć maskowania pola widzenia myszy (Rysunek 1b). Przyklej sztuczne końcówki paznokci do ramy za pomocą kleju cyjanoakrylowego.
UWAGA: Końcówki paznokci mogą pomóc chronić obiektyw przed zarysowaniem przez mysz. Kierunek opuszków paznokci musi być przeciwny, ponieważ górna ramka i dolna ramka są używane odpowiednio dla prawego i lewego oka. - Odczekaj co najmniej 12 godzin, aby klej całkowicie wyschł, a następnie za pomocą obcinacza do paznokci dostosuj kształt końcówek paznokci na około 1 cm × 1 cm, przycinając i przycinając.
- Przyklej soczewkę do oprawki za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Umieść obiektyw ręcznie na ramce i trzymaj oprawkę poziomo. Wstrzyknij klej cyjanoakrylowy od krawędzi soczewki i pozwól, aby klej rozprzestrzenił się pod wpływem napięcia powierzchniowego.
UWAGA: Klej spowoduje erozję soczewki i wpłynie na jej przezroczystość, więc upewnij się, że klej dotyka tylko peryferyjnej części soczewki. Użyj soczewki Plano 0 dioptrii (D) jako soczewki kontrolnej i ujemnej, aby wywołać krótkowzroczność. Wpływ różnych mocy soczewek ujemnych (od –10 D do –50 D) został opisany w innym miejscu4. Aby zmaksymalizować indukcję krótkowzroczności, do wywoływania krótkowzroczności zalecana jest soczewka –30 D. FDM można również indukować za pomocą tego samego urządzenia, po prostu zmieniając soczewkę w nasadkę mikrorurki 1,5 ml jako dyfuzor.
- Dokręć śrubę w nylonowym patyczku razem z podkładką od płaskiej strony drążka. Przygotuj odpowiednio okulary i patyczki przed eksperymentem i przechowuj je do dalszego użytku (Rysunek 1c).
UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany w tym miejscu.
2. Mocowanie ramy do czaszki myszy.
- Nałóż jedną kroplę 0,1% oczyszczonej kropli do oczu z hialuronianu sodu, aby zapobiec wysuszeniu każdego oka.
UWAGA: Krople do oczu na powierzchni oka będą miały wpływ na wartości pomiaru refrakcji i długości osiowej. Nie należy stosować kropli do oczu po znieczuleniu, dopóki nie zostaną wykonane wszystkie pomiary. - Połóż podbródek znieczulonej myszy na zboczu wykonanym z gliny lub czegokolwiek, co może służyć jako poduszka, aby przednia płaszczyzna czaszki była pozioma.
- Wysterylizuj włosy i skórę głowy między uszami a oczami za pomocą bawełnianego wacika z 70% etanolem.
- Przetnij skórę między uszami i oczami, aby odsłonić czaszkę na około 0,8 sq.cm za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety. Użyj płynu do trawienia zębów i bawełnianego wacika, aby usunąć okostną. Wysterylizuj nożyczki chirurgiczne i pęsetę 70% etanolem przed zabiegiem każdej myszy.
UWAGA: Może być wymagane strzyżenie włosów i noszenie sterylnych rękawiczek. Przed tą procedurą należy zapoznać się z przepisami odpowiedniej komisji ds. opieki nad zwierzętami. W większości przypadków płyn do trawienia zębów jest jednym z nasadek w samoutwardzalnym systemie adhezji dentystycznej. Jeśli płyn do trawienia zębów nie jest dostępny, zamiast niego użyj 70% etanolu. - Zmontuj zestaw ramek bez soczewki, aby pomóc zamocować drążek we właściwej pozycji. Umieść ramki na główce myszy. Ostrożnie wyreguluj położenie ramek, aby upewnić się, że oba oczy znajdują się pośrodku pustej ramki.
- Użyj samoutwardzalnego systemu kleju dentystycznego, aby przymocować patyczek do główki myszy. Uważaj, aby płyn z systemu przylegającego nie dostał się do oka myszy.
UWAGA: Metoda korzystania z samoutwardzalnego systemu adhezji dentystycznej różni się w zależności od produktu. Zapoznaj się dokładnie z instrukcją.
UWAGA: Niektóre odczynniki w systemie adhezji dentystycznej mogą być toksyczne. - Odczekaj około 5 minut i ostrożnie zdejmij ramę i nakrętkę, nie zmieniając położenia drążka (Rysunek 2a).
- Wstrzyknąć dootrzewnowo chlorowodorek atipamezolu w dawce 0,75 mg/kg, aby pomóc myszy szybciej dojść do siebie po znieczuleniu. Umieść mysz w osobnej klatce, aż w pełni wyzdrowieje. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. W tym miejscu protokół można wstrzymać.
3. Rozpoczęcie indukcji krótkowzroczności i jej późniejsze utrzymanie
- Odczekaj co najmniej 24 godziny po operacji, aby mysz mogła całkowicie wyzdrowieć ze znieczulenia. Chwyć kij i załóż oprawki z soczewkami. Zachęta rozpoczyna się w tym momencie (Rysunek 2b).
UWAGA: Aby zminimalizować dyskomfort podczas rekonwalescencji po znieczuleniu i dać wystarczająco dużo czasu na krzepnięcie systemu adhezjologicznego, zdecydowanie zaleca się założenie ramy po tym, jak myszy w pełni wyzdrowieją ze znieczulenia. Cement żywiczny systemu klejowego w pełni pokryje nacięcie skóry głowy. Dlatego nie jest potrzebne żadne specjalne leczenie pooperacyjne, aby zapobiec infekcji i złagodzić ból pooperacyjny. Zaraz po pierwszym założeniu oprawki myszy będą nadmiernie świadome istnienia soczewki i bardzo ją porysują. Obrzydliwe zachowanie wróci do normy po kilku godzinach. Myszy z soczewkami mogą być trzymane w tej samej gęstości co normalne myszy. - Zdejmij oprawkę i czyść soczewki i końcówki paznokci bawełnianymi wacikami co najmniej dwa razy w tygodniu, aby zachować przezroczystość soczewki.
UWAGA: Nie jest konieczne poddawanie myszy narkozie w celu zdjęcia i założenia ramki. Zapewnienie myszom wsparcia, na którym mogą siedzieć, zamiast zawieszania się podczas pracy z nimi, może zmniejszyć stres. - Jeśli konieczny jest pomiar tymczasowy, umieść mysz w znieczuleniu i zmierz mysz zgodnie z wcześniejszym opisem. Indukcja może być kontynuowana po powrocie myszy do zdrowia po znieczuleniu.
- Czyść klatkę co najmniej dwa razy w tygodniu.
UWAGA: Pomaga to zachować przejrzystość obiektywu. Pomocne może być również umieszczenie siatki między myszą a dnem klatki w celu filtracji resztek jedzenia. - Monitoruj masę ciała i zachowanie brutto. Porównaj je z nietkniętymi myszami w tym samym wieku podczas całego procesu eksperymentalnego.
UWAGA: Z wyjątkiem niektórych zachowań związanych z drapaniem, nie stwierdzono żadnych znaczących zmian, w tym masy ciała, między myszami eksperymentalnymi a myszami nieleczonymi.
