Modelowanie regeneracji aksonów czuciowych u szczura za pomocą iniekcji zwoju korzenia grzbietowego i uszkodzenia zmiażdżenia korzenia grzbietowego

Streszczenie

Źródło: Cheah, M., et al. Iniekcja ganglionu korzenia grzbietowego i uraz zmiażdżenia korzenia grzbietowego jako model regeneracji aksonów czuciowych. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film pokazuje krok po kroku procedurę wstrzykiwania zawiesiny wirusa do zwojów korzenia grzbietowego (DRG) i wywoływania kontrolowanego uszkodzenia aksonów poprzez zmiażdżenie korzenia grzbietowego u znieczulonego szczura. Protokół obejmuje odsłonięcie DRG, dostarczenie wektora wirusowego stymulującego wzrost w celu ułatwienia regeneracji aksonów oraz zerwanie połączeń aksonalnych z rdzeniem kręgowym w celu modelowania uszkodzenia nerwu czuciowego i regeneracji.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Wstrzyknięcie DRG i wykonanie urazu zmiażdżenia korzenia grzbietowego

UWAGA: To niezwykle delikatna operacja. Wskazane jest, aby najpierw poćwiczyć na kilku martwych zwierzętach, aby zapoznać się z anatomią przed przejściem do chirurgii na żywych zwierzętach.

1. Zlokalizuj widoczne wyrostki kolczyste C2 i T2 na skórze. Wykonaj nacięcie skóry między wyrostkami kolczystymi C2 i T2 za pomocą ostrza skalpela nr 10 (po otwarciu skóry na pierwszej warstwie mięśni powinna być widoczna biała, włóknista linia środkowa; pierwsza warstwa mięśnia ma "galaretowatą" teksturę).
2. Wykonaj nacięcie podobnej wielkości na pierwszej warstwie mięśnia wzdłuż białej linii środkowej za pomocą ostrza skalpela. Nie wychodź poza wydatny wyrostek kolczysty T2, ponieważ w pobliżu znajduje się główna gałąź tętnicza z aorty zstępującej.
   UWAGA: Obfite krwawienie może wystąpić w dowolnym miejscu od tego kroku. Zawsze tamuj krwawienie i usuwaj krew za pomocą wysterylizowanych patyczków kosmetycznych lub wchłanialnych gąbek chirurgicznych, aby umożliwić wyraźną wizualizację przez cały czas. Postępowanie "na ślepo" może skutkować niepożądanym uszkodzeniem rdzenia kręgowego, DRG lub korzenia grzbietowego, prowadząc do nieoczekiwanych działań niepożądanych u zwierzęcia w późniejszym czasie.
3. Wycofaj pierwszą warstwę mięśni za pomocą dwóch retraktorów, jednego umieszczonego rostralnie, a drugiego doogonowo; Druga warstwa mięśni, o wyglądzie prążkowanym, powinna być widoczna.
4. Zlokalizuj linię środkową drugiej warstwy mięśni (gdzie można zaobserwować dwa podłużne mięśnie połączone cienką, błoniastą tkanką). Wypreparuj tkankę błoniastą za pomocą mikronożyczek, aby oddzielić dwa mięśnie podłużne. Jeśli to możliwe, unikaj używania ostrza skalpela, ponieważ może to spowodować niepotrzebne uszkodzenie mięśni i krwawienie.
5. Wyreguluj odpowiednio zwijacze, aby odsłonić trzecią warstwę cienkiego mięśnia pokrywającego kręgosłup. Wyrostki kolczyste można wyczuć, lekko dotykając kleszczami trzeciej warstwy mięśni.
6. Wykonaj małe nacięcie na trzeciej warstwie mięśnia za pomocą mikronożyczek i delikatnie zeskrob mięsień z kości za pomocą kirety lub skalpela w bok, aby wyraźnie odsłonić kręgi. W razie potrzeby odetnij część mięśnia lub ścięgna, aby ułatwić laminektomię.
7. Aby odsłonić lewe DRG C5 - C8, wykonaj lewą hemi-laminektomię na kręgach C4 - T1, ostrożnie usuwając część blaszki i szypułki za pomocą pary cienkich rongeurs. DRG znajduje się w pobliżu otworu poprzecznego kręgów.
   UWAGA: Kręgi C3 - C7 nie mają wydatnego wyrostka kolczystego. C5 DRG znajduje się między kręgami C4 i C5, C6 DRG znajduje się między kręgami C5 i C6 i tak dalej, podczas gdy C8 DRG znajduje się między kręgami C7 i T1. Nie ma kręgu C8, pomimo obecności C8 DRG i segmentu rdzenia kręgowego C8.
8. Po wystawieniu wystarczającej ilości DRG do wstrzyknięcia, należy przygotować strzykawkę, umieszczając wypełnioną wirusem mikrolitrową strzykawkę wyposażoną w specjalnie wykonaną, tępą igłę o rozmiarze 33 na stereotaktycznym uchwycie strzykawki. Przed wstrzyknięciem należy użyć igły ze skosem w rozmiarze 30, aby wykonać mały powierzchowny otwór na każdym z docelowych DRG, aby pomóc w wprowadzeniu igły do wstrzykiwań.
9. Włóż igłę o rozmiarze 33 do środka DRG, delikatnie obracając pokrętła, aby dostosować współrzędne stereotaktyczne. Nie należy nadmiernie wkładać igły, ponieważ może to spowodować wyciek płynu z brzusznej strony DRG. W przypadku wystąpienia wycieku należy natychmiast wyregulować położenie igły.
   UWAGA: Numeryczne współrzędne stereotaktyczne nie są używane; Pomocne jest jednak wykorzystanie ramy do przytrzymania igły do wstrzykiwania.
10. Wstrzyknąć 1 μl wirusa do każdego DRG w tempie 0,2 μl/min za pomocą pompy strzykawkowej do infuzji. Odczekaj dodatkowe trzy minuty przed wyjęciem igły. Podczas wstrzyknięcia DRG będzie powoli zmieniać kolor, jeśli roztwór wirusa zawiera kolorowy barwnik.
11. Aby wykonać jednoczesne zmiażdżenie korzenia grzbietowego C5 - C8, zmiażdż każdy korzeń trzy razy przez 10 sekund za pomocą pary kleszczy z cienką końcówką (Bonn Micro), całkowicie przeciwległych końcówek kleszczy; W miejscu zgniecenia powinna pojawić się biała linia w tkance. Nie wchodź kleszczami głębiej niż jest to wymagane, ponieważ może to spowodować uszkodzenie korzenia brzusznego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fast Green FCF dye	Sigma-Aldrich	F7258	Do wizualizacji bezbarwnego roztworu. Zalecane stężenie: 1%
Olsen-Hegar needle holder	Fine Science Tools	FST 12502-12
Friedman Pearson Rongeur Zakrzywiony kubek 0,7 mm	Narzędzia do nauki pięknej	FST 16121-14
Kleszcze Micro Bonn	Fine Science Tools	FST 11083-07	Do wykonywania urazów zgniecenia korzenia grzbietowego
Nożyczki do separacji tkanek
Fine Science Tools	FST 14072-10
Fine Scissors	Fine Science Tools	FST 14058-11
Kleszcze Micro-Adson	styl
Goldstein Retractor	Fine Science Tools	FST 17003-03
Nożyczki sprężynowe Vannas (proste)	Fine Science Tools	FST 15018-10
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge	Ethicon	1972	For bleeding control
Microliter Syringe RN701 (10 μl)	Hamilton	80330
custom-made Removable Needle (do iniekcji DRG)	Hamilton	7803-05	33 gauge, 38 mm, point style 3
UltraMicroPump ze sterownikiem SYS-Micro4	World Precision Instruments	UMP3-1

obramowania><