Model minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego do badania aktywacji i migracji nerwowych komórek macierzystych

Streszczenie

Źródło: Lakshman, N., et al. Test neurosfery do oceny endogennej aktywacji nerwowych komórek macierzystych w mysim modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film pokazuje aktywację i migrację nerwowych komórek macierzystych (NSC) w mysim modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego. Aby odsłonić rdzeń kręgowy, z znieczulonej myszy usuwa się kręg z klatki piersiowej kręgosłupa. Następnie za pomocą wygiętej igły tworzy się powierzchowny uraz w istocie białej rdzenia kręgowego, który zachowuje kanał centralny. Po urazie NSC otaczające kanał są aktywowane i migrują do miejsca urazu, aby wspomóc naprawę tkanek.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Minimalna operacja urazu rdzenia kręgowego

UWAGA: Przed zabiegiem upewnij się, że wszystkie narzędzia i materiały chirurgiczne są sterylizowane odpowiednimi metodami (Rysunek 1A).

1. Zbuduj łuk podparcia klatki piersiowej, zwijając 4–5 kwadratów gazy i sklejając je ze sobą na środku, aby uzyskać stałą rolkę gazy.
2. Umieść mysz w komorze indukcyjnej i rozpocznij znieczulenie 5% izofluranem. Potwierdź brak odruchu szczypania palców u nóg przed kontynuowaniem, a także przez cały zabieg. Ponieważ operacja może trwać do 30 minut, zoptymalizuj ją pod kątem minimalnej ekspozycji na izofluran (5 minut przy 5%, a pozostały czas przy 2-3%).
3. Przenieść mysz do stożka nosowego podłączonego do aparatu znieczulającego w dawce podtrzymującej 2-3% izofluranu. Użyj maszynki do strzyżenia włosów, aby usunąć sierść z grzbietu zwierzęcia od połowy pleców do szyi/uszu, aby odsłonić szeroki prostokątny obszar skóry do operacji.
4. Przenieś mysz do instrumentu stereotaktycznego, umieszczając jej nos w dołączonym stożku nosowym i stabilizując czaszkę za pomocą pasków na uszy. Utrzymuj izofluran na poziomie 5% podczas zakładania pasków dousznych i w dolnej części pleców do 2–3%, gdy mysz jest zamocowana w urządzeniu stereotaktycznym.
5. Przedoperacyjne leki przeciwbólowe podawać dootrzewnowo — Meloksykam (2,0 mg/kg). Obficie nałóż smarowanie oczu na otwarte oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki w znieczuleniu.
6. Umieść łuk podtrzymujący klatkę piersiową pod brzuchem myszy, jednocześnie prostując ciało i kręgosłup myszy, lekko pociągając za podstawę ogona. Użyj laboratoryjnej taśmy do etykietowania, aby zabezpieczyć ogon i wszystkie wyprostowane kończyny w pozycji przypominającej gwiazdę. Po zabezpieczeniu popchnij podparcie klatki piersiowej w łuk rostralny od brzucha myszy w kierunku górnej części klatki piersiowej - w celu podparcia kręgosłupa piersiowego (Rysunek 1B).
7. Przygotować sterylne pole operacyjne, dezynfekując obszar skóry strzyżony sierścią przygotowany w kroku 1.3 70% etanolem, a następnie jodowidonem. Powtórz dwa razy. Zastosuj sterylną serwetę chirurgiczną, aby utrzymać szerokie sterylne pole.
8. Za pomocą ostrza skalpela #10 wykonaj pionowe nacięcie równoległe do osi podłużnej zwierzęcia od środkowego punktu obu łopatek do krzywizny kręgosłupa piersiowego. Cofnij skórę, aby odsłonić tkankę miękką i kontur kręgosłupa (Rysunek 1C).
9. Zidentyfikuj dolną granicę poduszeczki tłuszczowej nadłopatkowej (wyznacza ona poziom kręgów T4/5). Tym samym ostrzem #10, ostrożnie, ale z siłą, przetnij wzdłuż obu stron kości kręgowej T5–T8/9, aby odłączyć ścięgna mięśni pleców od kolumny.
10. Włóż zęby retraktorów w miejsca nacięć po obu stronach kręgosłupa. Dostosuj ekspozycję, rozszerzając zwijacze, aby wystarczająco unieść kręgosłup bez zbytniego obciążania schowanych warstw mięśni (Rysunek 1D).
11. Pod mikroskopem chirurgicznym ostrożnie oczyść resztki mięśni i inne tkanki miękkie pokrywające kręgosłup, aby odsłonić kość kręgową (Rysunek 1E). Zidentyfikuj kręgi, które zostaną usunięte, obejmując wyrostek kolczysty kręgów ząbkowanymi kleszczami i przesuwając go lekko w górę iw dół.
    UWAGA: Powinno to umożliwić identyfikację stawów międzykręgowych i odsłonić małe otwory (otwory międzykręgowe) pod kręgami będącymi przedmiotem zainteresowania.
12. Włóż jedną główkę zakrzywionych, tępych nożyczek po obu stronach odsłoniętego otworu międzykręgowego, doogonowo do blaszki kręgowej, która ma zostać wycięta, i obustronnie przetnij łączące stawy międzykręgowe.
13. Podnieś blaszkę do góry i odetnij górne przyczepienie blaszki, aby wyizolować i usunąć kość.
    UWAGA: Spowoduje to odsłonięcie nienaruszonego worka oponowego zawierającego rdzeń kręgowy (Rysunek 1F). Może wystąpić nadmierne krwawienie, które można opanować, umieszczając wstępnie przyciętą gazę o wymiarach 1 cm x 1 cm na dotkniętych obszarach i/lub przemycie sterylną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
14. Mając żyłę grzbietową linii środkowej służącą jako punkt orientacyjny, włóż zgięty pod kątem 45° trzon końcówki igły 30 G (ze skosem igły skierowanym do góry) w grzbietowo-boczną powierzchnię rdzenia kręgowego (o głębokości około 1 mm) w odległości około 0,5 mm z boku po obu stronach linii środkowej.
15. Przesunąć igłę o ~2 mm od ogona do rostralu (równolegle do linii środkowej) tak, aby cała długość skosu igły została włożona w sznurek. Usuń igłę, śledząc ją ponownie ścieżką wejścia (Rysunek 1G).
    UWAGA: Nie powinno być krwawienia, ale na tym etapie można zauważyć obrzęk tkanki rdzeniowej.
16. Aby zamknąć ranę, zdejmij retraktor i zszyj mięśnie pleców po obu stronach urazu razem w linii środkowej za pomocą szwu wchłanialnego 6-0. Użyj sterylnego jedwabnego szwu 4-0, aby następnie zamknąć leżącą na powierzchni skórę.

Wyniki

Rysunek 1: Zabieg chirurgiczny. (A) Układ wszystkiego, co jest potrzebne, ponumerowany w celach informacyjnych. (B) Zdjęcie myszy w urządzeniu stereotaktycznym z wyprostowanym ciałem, kręgosłupem i kończynami rozłożonymi i zaklejonymi taśmą wraz z umieszczonym pod spodem łukiem podtrzymującym klatkę piersiową. (C) Zdjęcie myszy z pionowym nacięciem sk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agricola Retraktor	Narzędzia naukowe	17005-04
Moria Nożyczki sprężynowe Vannas-Wolff (zakrzywione)	Narzędzia naukowe	15370-50	Dostosuj przy zamawianiu, aby uzyskać tępe końcówki
Kleszcze Graefe (proste, zęby 1x2)	Narzędzia Nauki Pięknej	11053-10
Bardzo cienkie kleszcze Graefe (zakrzywione, ząbkowane)	Narzędzia do nauki precyzyjnej	11152-10	Lub inne kleszcze do szycia
Hemotyty Hartmana (proste)	Narzędzia Nauki Pięknej	13002-10	Lub inne odpowiednie do szycia
Uchwyt skalpela #3	Narzędzia do nauki pięknej	10003-12	Lub inne odpowiednie
Maszynki do strzyżenia włosów	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA	lub inne odpowiednie
Instrument stereotaktyczny	Stoeling	51500	lub inne odpowiednie
Meloxicam			lub inne odpowiednie sankcjonowane przez placówkę
Tears Naturale P.M.	Alcon	https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE	lub inne odpowiednie
Isoflurane	Baxter International Inc	DIN 02225875	lub inna odpowiednia do znieczulenia
Końcówki Q-Cottom Swabs	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS
Gaza bawełniana	Fisher Scientific	13-761-52
Igły 30G	Becton Dickinson	305106	Dla urazu
25G	Becton Dickinson	305122	Do wstrzykiwań
Strzykawki 1mL	Becton Dickinson	3090659	do wstrzykiwań
Strzykawki 3mL	Becton Dickinson	309657	do iniekcji płynów
4-0 Szew	uoftmedstore.com	2297-VS881	do szycia
6-0 Szew	uoftmedstore.com	VS889	do szycia
standardowe narzędzia do preparowania	Narzędzia naukowe
Mikroskop preparacyjny	Zeiss	Stemi 2000

opieki nad zwierzętami leków leków skóry mięśni