Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia nerwów u myszy transgenicznej

Streszczenie

Źródło: Breid, S., et. al. Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókienek alfa-synukleiny. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film demonstruje obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych, prezentując reakcje lucyferazy-lucyferyny w aktywowanych astrocytach. Protokół umożliwia nieinwazyjną kwantyfikację aktywacji astrocytarnej, wspomagając badania nad zapaleniem OUN i skutecznością terapeutyczną.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

Model zwierzęcy

1. Myszy półkrzyżowe Tg(Gfap-luc+/-) z hemizygotycznymi myszami Tg(M83+/-) w celu wygenerowania hemizygotycznych bigenicznych myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-).
2. Genotyp potomstwa za pomocą PCR w czasie rzeczywistym na obecność transgenu kodującego ludzką alfa-synukleinę oraz za pomocą standardowego PCR dla lucyferazy świetlika.
3. Zaszczepić zwierzęta w wieku od sześciu do ośmiu tygodni.

Przygotowanie inokulum

1. Przygotuj monomeryczną rekombinowaną ludzką alfa-synukleinę z mutacją A53T w buforze soli fizjologicznej buforowanym trisem (TBS) zawierającym 150 mM NaCl w 20 mM Tris-HCl (pH 7,2).
2. Przygotować fibrylarną alfa-synukleinę do inokulacji, mieszając 3 μg/μl monomerycznej rekombinowanej ludzkiej alfa-synukleiny w wytrząsarce orbitalnej przy 800 obr./min i temperaturze 37 °C przez 5 dni.
3. Rozcieńczyć zespoły fibryli w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), aby osiągnąć końcowe stężenie 1 μg/μl do inokulacji dootrzewnowych.
4. Fragmentuj fibryle alfa-synukleiny za pomocą sonikatora pręcikowego przez 1 minutę (40 impulsów o czasie trwania 0,5 s z jednosekundową przerwą między każdym impulsem i amplitudą ustawioną na 50%) na lodzie. Aby uniknąć zanieczyszczenia przez siew krzyżowy. Użyj czystych sond sonicznych, aby przygotować różne inokulum.

Wstrzyknięcia dootrzewnowe

1. W przypadku wstrzyknięć dootrzewnowych należy krótko odzareagować zwierzęta w komorze anestezjologicznej poprzez inhalację izofluranem/tlenem, przy natężeniu przepływu 2 l/min i parowniku ustawionym na 2%. Uszczypnij palec u nogi zwierzęcia i upewnij się, że nie wycofuje tylnej kończyny, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie.
2. Napełnij jednorazową strzykawkę podskórną o pojemności 27 g 50 μl sonikowanych włókien alfa-synukleiny lub PBS.
3. Należy wstrzykiwać bezpośrednio do otrzewnej myszy i unikać przenikania do jelita cienkiego lub jelita ślepego znajdującego się za ścianą jamy brzusznej, trzymając zwierzę w pozycji grzbietowej z głową skierowaną w kierunku przeciwnym do badacza i w dół pod kątem około 45°. Monitoruj zwierzęta, dopóki nie wyzdrowieją ze znieczulenia.

Obrazowanie bioluminescencyjne

1. Image Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) myszy co 2-4 tygodnie przy użyciu systemu obrazowania bioluminescencyjnego.
2. Przed obrazowaniem należy krótko znieczulić myszy w komorze izofluranowo-tlenowej o natężeniu przepływu 2 l/min i parowniku ustawionym na 2%. Uszczypnij palec u nogi zwierzęcia i upewnij się, że nie wycofuje tylnej kończyny, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie.
3. Ogol i wypiluj głowy myszy kremem do depilacji. Pokoloruj uszy na czarno niedrażniącym markerem, aby zablokować niespecyficzną bioluminescencję.
4. Rozcieńczyć sól potasową D-lucyferyny, substrat lucyferazy, w PBS do roztworu podstawowego o stężeniu 30 mg/ml. Przechowywać w 1 ml porcji w temperaturze -20 °C. Chronić rozpuszczoną D-lucyferynę przed ekspozycją na światło.
5. Zważyć zwierzęta przed wstrzyknięciem. Oblicz dokładną objętość D-lucyferyny do wstrzyknięcia 150 mg/kg masy ciała. Dootrzewnowo wstrzyknąć D-lucyferynę i zwrócić zwierzę do komory anestezjologicznej.
6. Uruchom oprogramowanie do obrazowania. Gdy system obrazowania osiągnie temperaturę roboczą, zainicjuj go, klikając przycisk "Zainicjuj" na panelu sterowania.
7. Wybierz przyciski "Luminescencyjny" i "Fotografia". Ustaw czas ekspozycji na 60 s, binning na "Średni", przysłonę przysłony na "1", a wzmocnienie EM na "Wył.".
8. Upewnij się, że filtr wzbudzenia jest ustawiony na "Blok", a filtr emisji na "Otwarty" i ustaw wysokość obiektu na 1,50 cm.
9. Dziesięć minut po wstrzyknięciu D-lucyferyny umieść zwierzęta na płycie grzewczej w komorze obrazowania i upewnij się, że ich pyski są prawidłowo umieszczone w wylocie znieczulenia. Zamknąć przepływ izofluranu/tlenu z komory inhalacyjnej i otworzyć przepływ do komory obrazowania o natężeniu przepływu 0,25 l/min i parowaniu 2%. Prawidłowo zamknij drzwiczki komory obrazowania.
10. Kliknij przycisk "Pobierz", aby zmierzyć bioluminescencję, która trwa 60 s.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
27	VWR	613-4900
Isoflurane	Piramal Healthcare	PZN 4831850
Krem do depilacji	Veet
Marker laboratoryjny Secureline	Neolab	25040
sól potasowa D-lucyferyny	LK10000	30 mg/ml roztwór
Thermomixer	Eppendorf	5776671
Sonopuls Mini20 sonikator	Bandelin	3648
System obrazowania IVIS Lumina II	PerkinElmer
Oprogramowanie Living Image 3.0	PerkinElmer
Tg(M83+/-) myszy lub B6; C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J myszy	Laboratorium Jacksona	4479

< td style='szerokość:98 pkt;'>Acris podstawowy