Dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Streszczenie

Źródło: Wang, Z., et al. Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film przedstawia technikę obrazowania siatkówki in vivo przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Znieczulone myszy są przygotowywane do obrazowania poprzez zabezpieczenie głowy, nałożenie lubrykantu do oczu i umieszczenie szkiełka nakrywkowego na oku. Komórki zwojowe siatkówki (RGC) eksprymujące białka fluorescencyjne są najpierw wizualizowane za pomocą epifluorescencji w celu wyrównania. Na koniec zastosowano obrazowanie dwufotonowe, co pozwala na wizualizację RGC w wysokiej rozdzielczości.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie myszy do akwizycji obrazu

1. Znieczulenie myszy do obrazowania
   UWAGA: Aby zminimalizować narażenie na izofluran, należy zapewnić prawidłowe oczyszczanie gazów odlotowych. Upewnij się, że otwór wylotowy komory indukcyjnej anestezjologii jest podłączony do pasywnego pojemnika z filtrem gazu przedmuchującego, a wylot noska do znieczulenia myszy jest podłączony do aktywnego pojemnika z filtrem gazu z podciśnieniem zapewnianym przez aparat do odprowadzania gazu. Postępuj zgodnie z wytycznymi producenta dotyczącymi monitorowania masy kanistra filtra w celu wymiany.
   1. Znieczulij mysz za pomocą koktajlu ketamina/ksylazyna. Alternatywnie, wywołać znieczulenie poprzez inhalację izofluranu, jeśli również stosuje się izofluran do podtrzymania znieczulenia (sesja obrazowania > 30 min). Ustawić urządzenie do znieczulania małych zwierząt tak, aby napełniło komorę indukcyjną 5% izofluranem zmieszanym z powietrzem w pomieszczeniu o natężeniu przepływu 0,5 l/min. Umieść mysz w komorze indukcyjnej i odczekaj 15 sekund, aż mysz zostanie znieczulona.
   2. Przełącz parownik izofluranu na 0% i skieruj strumień znieczulenia do końcówki. Wykonaj 5-sekundowe płukanie komory indukcyjnej "O₂". Wyjmij mysz z komory indukcyjnej i zabezpiecz ją w uchwycie na głowę, mocując końcówkę.
   3. Do podtrzymania znieczulenia należy użyć mieszaniny 1% izofluranu z powietrzem w pomieszczeniu o natężeniu przepływu 0,5 l/min. Monitoruj częstość oddechów w 5-minutowych odstępach czasu przez cały czas znieczulenia, dostosowując procentową zawartość izofluranu, aby utrzymać częstość oddechów na poziomie ~60 oddechów/min.
      UWAGA: Te ustawienia (% izofluranu, szybkość przepływu) mogą być również wykorzystane do utrzymania znieczulenia wywołanego przez koktajl ketaminy/ksylazyny.
2. Rozszerzenie źrenicy
   1. Przygotuj roztwór 1% w/v atropiny i 2,5% w/v chlorowodorku fenylefryny w wodzie. Roztwór rozszerzacza należy przechowywać w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
   2. Za pomocą jednorazowego zakraplacza do oczu z pipetą nałóż kroplę roztworu rozszerzacza na każde oko, które będzie obrazowane. Wyłącz światła w pomieszczeniu i odczekaj 5 minut, aż źrenica się rozszerzy. Gdy źrenica jest rozszerzona, zetrzyj roztwór rozszerzacza niestrzępiącą się chusteczką.
      UWAGA: Upewnij się, że roztwór rozszerzacza nie dostaje się do nozdrzy.
   3. Nałóż dużą kroplę nawilżającego żelu pod oczy na każde oko, które zostanie zobrazowane. Jeśli ma być obrazowane oba oczy, nałóż mały kawałek plastikowej folii spożywczej na żel do oczu na oku nieobrazowym, aby zapobiec odwodnieniu. Jeśli obrazujesz tylko jedno oko, nałóż smarującą maść do oczu na oko, które nie będzie obrazowane.
3. Pozycjonowanie myszy do obrazowania
   1. Aby zamocować mysz w uchwycie głowicy obrazowania, obróć główne ramię uchwytu głowy, aż listwa słuchawki zostanie przechylona pod kątem 60° lub więcej poniżej poziomu. Zamocuj dolny sworzeń przewodu słuchowego w pozycji wysuniętej do wewnątrz, a sworzeń górnego przewodu słuchowego w pozycji wycofanej.
   2. Trzymając mysz skierowaną w stronę belki gryzowej, zamontuj jedno ucho na przedłużonym dolnym bolcu, wkładając szpilkę do kanału słuchowego. Poluzuj śrubę mocującą sworzeń górnego kanału słuchowego i wsuń kołek do drugiego kanału słuchowego. Dokręć śrubę, aby zabezpieczyć głowicę.
   3. Przesuń pasek gryzienia w kierunku głowy myszy. Delikatnie podnieś głowę myszy, a następnie opuść siekacze szczęki myszy do otworu pręta gryzowego. Wsuń belkę gryzową z delikatną siłą, aby zabezpieczyć główkę myszy, i zabezpiecz pozycję belki gryzowej, dokręcając śrubę.
   4. W przypadku stosowania izofluranu należy wsunąć końcówkę nosa przez szczelinę na pręt gryzący przed zabezpieczeniem siekaczy myszy. Zabezpiecz i dokręć pozycję belki zgryzowej, jak w kroku 1.3.3. Dokręć końcówkę za pomocą dwóch śrub na jej górnej powierzchni, aż będzie ściśle przylegać do nosa myszy, ale nie uciskać pyska.
   5. Przenieś mysz w uchwycie na głowę do stolika mikroskopowego pod obiektywem. Obracaj głównym ramieniem uchwytu głowy, aż źrenica oka będzie skierowana prosto do góry, zgodnie ze ścieżką światła (Rysunek 1).
   6. Umieść szkiełko nakrywkowe #1.5 w kompaktowym uchwycie filtra i przymocuj uchwyt do stolika mikroskopu. Opuść szkiełko nakrywkowe w kierunku oka, stykając się z lubrykantem żelowym do oczu, tak aby leżało poziomo bezpośrednio nad rogówką (Rysunek 1). Upewnij się, że szkiełko nakrywkowe nie dotyka rogówki.
      UWAGA: Na mikroskopie upewnij się, że ścieżka światła wzbudzenia jest ustawiona na epifluorescencję, a ścieżka światła emisyjnego jest ustawiona na okular. Włącz oświetlacz epifluorescencyjny z najniższą mocą i otwórz migawkę oświetlacza. Wybierz długość fali iluminatora epifluorescencji i filtr fluorescencyjny odpowiadający obrazowanemu fluoroforowi.
   7. Manewruj stolikiem w wymiarach X-Y i obiektywem w pozycji Z za pomocą stage control i zmotoryzowanego napędu ostrości, aż światło wzbudzenia o szerokim polu całkowicie pokryje rogówkę. Patrząc przez okular, kontynuuj regulację pozycji Z stolika, aż fluorescencyjne komórki lub struktury w siatkówce staną się ostre. Zwiększ moc iluminatora epifluorescencji, jeśli sygnał próbki nie jest wystarczająco jasny, aby rozdzielić poszczególne komórki lub struktury zainteresowania przez okular.
      UWAGA: Jeśli masz problem ze zlokalizowaniem siatkówki, tęczówka jest punktem orientacyjnym o wysokim kontraście, na którym można się zakotwiczyć, a następnie skupić się w dół w kierunku siatkówki. Ten krok pozwoli również na weryfikację, czy źrenica jest maksymalnie rozszerzona.
   8. Uzyskaj obszar obrazowania na osi za pomocą soczewki myszy. Dostosuj kąt myszy, używając różnych stopni swobody na uchwycie głowy, aż podczas regulacji płaszczyzny ogniskowej nastąpi tylko rozszerzanie lub kurczenie się nieostrego światła. Wyłącz oświetlacz epifluorescencyjny i zamknij migawkę iluminatora.
      UWAGA: Znaczna paralaksa X-Y nieostrego światła podczas przewijania płaszczyzn ogniskowych w kierunku Z wskazuje, że siatkówka nie znajduje się na osi w stosunku do ścieżki światła obrazowania.

2. Akwizycja obrazu dwufotonowego

1. Parametry konfiguracji i akwizycji obrazu
   UWAGA: Wyłącz światła w pomieszczeniu i zasłoń rozproszone źródła światła w pomieszczeniu. Upewnij się, że oświetlacz epifluorescencyjny jest wyłączony, a migawka oświetlacza jest zamknięta.
   1. Przełącz ścieżkę światła wzbudzenia na laser, a ścieżkę światła emisyjnego na lampy fotopowielacza (PMT).
   2. W oprogramowaniu do akwizycji obrazów ustaw rozmiar klatki 512 x 512 i średnią klatek 3. Ustaw kroki na plasterek na -8 μm. Wyznacz krok z, aby zaczynać od szczytu stosu i postępować w dół, minimalizując dwufotonową aktywację laserową fotoreceptorów.
      UWAGA: Rozmiar kroku można zmniejszyć, aby zwiększyć rozdzielczość Z kosztem wydłużonego czasu obrazowania, ale kroki 8 μm są wystarczające do rozpoznania somatów komórkowych w tej konfiguracji obrazowania.
   3. Włącz i włącz PMT. Ustaw napięcie PMT na 680 V. Włącz migawkę wzbudzenia.
      UWAGA: Zasilane PMT są podatne na uszkodzenia świetlne. Upewnij się, że oświetlacz epifluorescencyjny jest wyłączony, kurtyna obudowy mikroskopu jest zaciągnięta, a światła w pomieszczeniu są wyłączone.
   4. Rozpocznij podgląd na żywo obrazu tkanki docelowej, zaczynając od 1% mocy lasera. Automatycznie dostosuj jasność wyświetlacza, aby wyświetlić interesujące komórki lub struktury. Automatycznie dostosuj fazę skanowania. Jeśli tkanka docelowa jest przyciemniona lub niewyraźna, należy zwiększać procentową moc lasera, aż struktury staną się widoczne bez przekroczenia limitu ustalonego w kroku 2.4.4, który odpowiada 45 mW.
      UWAGA: Dla obrazu 16-bitowego, wyświetlana wartość ~1000, gdy automatyczne dostosowanie jasności w płaszczyźnie Z zawierającej interesujące nas struktury wskazuje wystarczającą jasność próbki.
   5. Manewruj stolikiem mikroskopu w kierunku X-Y, aby wyśrodkować żądany obszar obrazowania, a następnie przejdź do płaszczyzny Z z ostrymi strukturami.
      UWAGA: Obrazowanie w sąsiedztwie głowy nerwu wzrokowego pozwala jej służyć jako jednoznaczny punkt orientacyjny dla eksperymentów z obrazowaniem przewlekłym.
   6. Jeśli jest to przewlekły eksperyment poklatkowy, otwórz poprzedni obraz na komputerze akwizycyjnym i użyj go jako odniesienia, aby znaleźć ten sam obszar zainteresowania. Upewnij się, że kąt obrazowania jest podobny do kąta poprzednich obrazów, aby uzyskać ten sam zestaw komórek z minimalną paralaksą.
      UWAGA: Aby zobrazować te same komórki, co w poprzednich punktach czasowych (Rysunek 2), prawdopodobnie wymagana jest dalsza korekta pozycji głowy myszy.
   7. Ustaw granice Z stosu obrazowania, przechodząc do najwyższej i najniższej płaszczyzny Z będącej przedmiotem zainteresowania, a następnie uzyskaj obraz. Po zakończeniu akwizycji obrazu wyłącz PMT i migawkę emisyjną. Przełącz ścieżkę światła emisyjnego z powrotem na okular, a ścieżkę światła wzbudzenia na oświetlenie epifluorescencyjne. Wyjmij mysz ze stolika mikroskopu.

Wyniki

Rycina 1: Pozycjonowanie myszy do obrazowania in vivo. Aby ustawić mysz ze źrenicą na osi ze ścieżką światła, znieczulona mysz jest najpierw unieruchomiona w uchwycie na głowę, głowa jest obracana i ustawiana pod kątem, na oko umieszcza się dużą kroplę smarnego żelu do oczu, a mysz umieszcza się na scenie. Szkiełko nakrywkowe jest montowane w uchwyc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
#1.5 szkiełko nakrywkowe	ThermoFisher	152440	Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm
50 mL	Igła	80950	22G
Pompa powietrza anestezjologicznego	RWD Life Science	R510-30
Atropina	Sigma	A0132	Do rozwiązania
Podstawowe urządzenie do znieczulenia małych zwierząt	RWD Life Science	R500IE
Kapilara ze szkła borokrzemianowego	Sutter	B150-86-10	Średnica zewnętrzna 1,50 mm, średnica wewnętrzna 0,86 mm, długość 10 cm
Kostka filtra CFP/YFP	Chroma	custom	480/40, 505 long pass, 535/30
ChromoFlex - Dwukanałowa jednostka detekcyjna PMT	Scientifica	S-MPLG-1002
Pompa ciepła obiegowa	Braintree Scientific	tp-700	Ustawiona na 37 °C
Folia spożywcza	VWR	10713-916
Kompaktowy uchwyt filtra	ThorLabs	DH1	Trzyma szkiełko nakrywkowe nad okiem
Myszy transgeniczne Cx3cr1-GFP (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J)	The Jackson Laboratory	5582
Obudowa kontrolera DAQ	National Instruments	PXIe-1073
Urządzenie do akwizycji danych	National Instruments	BNC-2090A
Moduł FPGA z digitizerem	National Instruments	NI-5734
Aparat do odprowadzania gazu	RWD Life Science	R546W
GenTeal Severe lubrykant żel do oczu	Alcon	(z lokalnej apteki)	Do stosowania podczas obrazowania
GFP/Czerwona kostka filtracyjna	Chroma	custom	535/30, 560 long pass, 605/70
Poduszka grzewcza	McKesson Medical and Surgical	190147
Optyka HyperScope Launch do użytku z Pockels Cell	Scientifica	S-MP-101080
Moduł główny HyperScope	Scientifica	S-MP-100466
HyperScope Scan Path	Scientifica	S-MP-100406
HyperScope X galvo Module	Scientifica	MP-100443
Oprogramowanie ImageJ Fiji		Freeware
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC 14043-704-06
Kanister z filtrem gazowym izofluranu (aktywne oczyszczanie)	RWD Life Science	R510-31
Kanister z filtrem gazu izofluranu (pasywne oczyszczanie)	RWD Life Science	R510-31S
ketamina HCl (100 mg/mL)	Vedco	NDC 50989-161-06
Adapter M32 na M26	ThorLabs	M32M26S
Oprogramowanie MaiTai GUI	Spectra-Physics	NA
Oprogramowanie MATLAB	MathWorks	NA	R2015b
meloksykam (5 mg/ml)	Boehringer Ingelheim	NDC 0010-6013-01	Analgesic
Micorscope Objective	Edmund Optics	46-404	Mitutoyo WE715042319
ściągacz do mikropipet	Sutter	Flaming/Brown Model P-97
Olej mineralny	Fisher	BP2629-1
Zacisk hemostatyczny Mini bulldog	Fine Science Tools	18053-28
Miniaturowa rurka EVA 0.02" ID, 0.06" OD	McMaster Carr	1883T1
Miniaturowa rurka EVA 0.05" ID, 0.09" OD	McMaster Carr	1883T4
Uchwyt na głowę myszy	Narishige	SGM-4
Kleszcze nr 5	Narzędzia naukowe	11251-10
Słupki optyczne 1/2"	ThorLabs	TR3-P5
Zestaw miernika mocy optycznej	ThorLabs	PM100D
pE-300 Ultra LLG Deivery	Scientifica	COO-LED3ULLGs
Chlorowodorek fenylefryny	Sigma	P6126	Do roztworu
Pockels cell	Conoptics	350-80-02
Wzmacniacz komórkowy Pockels	Conoptics	Model 302RM
Chlorowodorek proparakainy	Sigma	1571001	Do unieruchomienia
Filtr krótkoprzepustowy Red & Far Red Cube	Chroma	custom	560 short pass
Obrotowy zacisk słupkowy 1/2"	ThorLabs	SWC
Pakiet ScanImage	Vidrio Technologies	Freeware	Oprogramowanie do akwizycji obrazów; Wersja 5.4.0 (2018); wymaga MATLAB
roztwór chlorku sodu, sterylny (0.9%)	Fresenius Kabi	NDC 63323-186-01
Stereomikroskop	Leica	S9 E
Wirówka stołowa	Oxford	Benchmate C8
Terramycyna oksytetracyklina/polimyksyna B antybiotyk maść okulistyczna	Zoetisus	NA	Do stosowania po wstrzyknięciu doszklistkowym
System chłodzenia ThermoRack	Systemy chłodzenia półprzewodnikowego	ThermoRack 401 Ustawione	na 20 °C
Ultraszybki laser Ti:Sapphire	Spectra-Physics	Mai Tai DeepSee
Myszy transgeniczne Vgat-Cre (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)	The Jackson Laboratory	16962
Myszy transgeniczne VGlut2-Cre (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J)	The Jackson Laboratory	16963
VivoScope do obrazowania In Vivo	Scientifica	S-MPVS-1200-00P
Biała maść do oczu z olejem wazelinowo-mineralnym	Stye	NA	Dla stosować po obrazowaniu
ksylazyna HCl (20 mg/mL)	Akorn	NDC 59399-110-20

cementowana Hamilton rozszerzającego źrenicę myszy rozszerzacza źrenicy oka