Dwukolorowe, stymulowane obrazowanie rozpraszania Ramana tkanki mózgowej myszy

Streszczenie

Źródło: Espinoza, R., et al. Dwukolorowe, stymulowane w czasie rzeczywistym obrazowanie rozpraszania Ramana mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek. J. Vis. exp. (2022).

Film przedstawia dwukolorowe, stymulowane rozpraszanie Ramana (SRS) wycinków tkanki mózgowej myszy. Dwie zsynchronizowane wiązki laserowe są kierowane na przekrój tkanki w celu wzbudzenia drgań molekularnych, co powoduje względną zmianę intensywności wiązek. Lipidy i białka w tkance są wykrywane za pomocą różnych par częstotliwości wiązek laserowych. Powstałe sygnały są następnie przypisywane do oddzielnych kolorów, tworząc dwukolorowy obraz, który pomaga zidentyfikować białka i lipidy w tkance.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Detekcja sygnału SRS

1. Modulacja elektrooptyczna (EOM)
   UWAGA: EOM 20 MHz służy do modulacji amplitudy Stokesa. Jak omówiono później, EOM wywodzi się z ciągu impulsów laserowych 80 MHz, który jest wymagany do modulacji ortogonalnej. Inne częstotliwości modulacji mogą być używane, jeśli wykonywany jest tylko jednokolorowy lub hiperspektralny SRS. W takim przypadku synchronizacja częstotliwości modulacji z częstotliwością lasera nie jest konieczna. Generator częstotliwości ze wzmacniaczem mocy o częstotliwości radiowej (RF) może być używany do sterowania EOM. W rezultacie kroki 1.1.1-1.1.4 można pominąć.
   1. Umieść próbnik wiązki na ścieżce wiązki Stokesa, aby odebrać 10% wiązki i wysłać ją do szybkiej fotodiody w celu wykrycia ciągu impulsów 80 MHz.
      UWAGA: Sygnał fotodiody jest wysyłany do dzielnika częstotliwości w celu wygenerowania wyjścia TTL 20 MHz. To wyjście jest następnie wysyłane do bufora fanout w celu replikacji wyjścia do czterech identycznych wyjść 20 MHz. Jedno z wyjść służy do wyzwalania oscyloskopu.
   2. Weź jedno z wyjść bufora fanout i przefiltruj je filtrem pasmowoprzepustowym, aby uzyskać falę sinusoidalną 20 MHz. Użyj tłumika RF, aby dostosować napięcie wyjściowe między szczytami do ~500 mV.
   3. Wyślij wynikowe wyjście do przesuwnika fazowego, który umożliwia precyzyjną regulację fazy RF za pomocą źródła napięcia. Wyślij to wyjście do wzmacniacza mocy RF i podłącz wyjście amplifier do EOM.
   4. Odblokuj wiązkę Stokesa i zoptymalizuj głębokość modulacji EOM1, umieszczając fotodiodę na ścieżce wiązki. Dostosuj napięcie EOM i płytkę ćwierćfalową, aż głębokość modulacji (stosunek doliny do szczytu) wydaje się zadowalająca.
      UWAGA: Przy modulacji 20 MHz (1/4 częstotliwości powtarzania lasera) spodziewane są dwa impulsy co 50 ns.
2. Nakładanie się czasowe
   UWAGA: Czasowe nakładanie się pompy i Stokesa uzyskuje się poprzez opóźnienie jednego z dwóch ciągów impulsów laserowych za pomocą retroreflektora zamontowanego na stopniu opóźniającym (Rysunek 1 pokazuje opóźnienie Stokesa). Zgrubne nakładanie się jest monitorowane za pomocą oscyloskopu, a dokładne nakładanie jest monitorowane przez sygnał SRS. Dokładne nakładanie się czasowe można również osiągnąć za pomocą autokorelatora, jeśli jest dostępny.
   1. Umieść fotodiodę za lustrem dichroicznym, aby wykryć wiązkę laserową. Najpierw zablokuj belkę Stokesa. Powiększ jeden ze szczytów impulsów pompy na oscyloskopie. Umieść pionowy kursor, aby zaznaczyć czasowe położenie tego piku za pomocą oscyloskopu.
   2. Zablokuj belkę pompy i odblokuj belkę Stokesa. Przetłumacz opóźnienie stage, aby czasowo dopasować pozycję szczytową na oscyloskopie do zaznaczonej pozycji w poprzednim kroku. Zobacz Rysunek 2 dla przedstawienia czasowego nakładania się dwóch belek.
      1. (OPCJONALNIE) Jeśli translacja stopnia opóźniającego jest niewystarczająca do czasowego dopasowania dwóch wiązek, przesuń stopień opóźniający do środka jego zakresu ruchu.
      2. Oblicz odległość opóźnienia wymaganą do dopasowania dwóch wiązek, biorąc różnicę czasową między dwiema wiązkami i mnożąc różnicę przez prędkość światła, aby znaleźć odległość potrzebną do czasowego dopasowania dwóch wiązek.
      3. Wydłuż tor wiązki szybszej wiązki lub skróć tor wiązki wolniejszej wiązki, aby z grubsza dopasować odpowiednio opóźnienie czasowe.
   3. Przygotować próbkę szkiełka mikroskopowego z dimetylosulfotlenkiem dimetylu (DMSO) i taśmą dwustronną jako przekładką do przytrzymania próbki między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym.
   4. Umieść próbkę na mikroskopie stroną z szkiełkiem nakrywkowym skierowaną w stronę obiektywu mikroskopu. Zmień mikroskop na oświetlenie jasnego pola i obserwuj próbkę z okularu. Znajdź punkt skupienia próbki, znajdując najpierw punkt skupienia zarówno na górnej, jak i dolnej warstwie pęcherzyków powietrza na styku taśmy szklanej, a następnie przesuń fokus tak, aby znajdował się między dwiema warstwami taśmy.
      UWAGA: Upewnij się, że wiązki laserowe są zablokowane, zanim spojrzysz w okular.
   5. Ustaw moc wyjściową wiązki przestrajalnej na 798 nm. W oparciu o przepustowość optyczną kondensatora, dostosuj moc optyczną na ~40 mW dla pompy i wiązek Stokesa na ognisku obiektywu.
   6. Otwórz ScanImage w MATLABie (lub innym oprogramowaniu do skanowania, które steruje mikroskopem) i kliknij przycisk oznaczony FOCUS , aby rozpocząć skanowanie.
      UWAGA: Wiązki laserowe zostaną zeskanowane rastrowo przez próbkę w celu wygenerowania obrazu. Sygnał wyjściowy niskiej częstotliwości z fotodiody (<100 kHz) jest przesyłany bezpośrednio do kanału 1 karty akwizycji danych (określanego jako kanał DC). Wyjście wysokiej częstotliwości (>100 kHz) z fotodiody jest wysyłane do wzmacniacza lock-in, a wyjście X sygnału wzmacniacza lock-in jest wysyłane do kanału 2 karty akwizycji danych (określanego jako kanał AC).
   7. Wyreguluj lusterko kierownicze przed skanerem galvo, aby wyśrodkować sygnał DC na wyświetlaczu kanału 1. Przesuń zmotoryzowany stopień opóźniający i uważnie obserwuj wyjście blokujące pokazane na wyświetlaczu kanału 2 (tj. kanału AC).
      UWAGA: Gdy pompa i Stokes zbiegną się w czasie, na kanale AC pojawi się sygnał. Pomocne jest dostosowanie skali kolorów kanału AC w celu wyświetlenia niewielkiej zmiany intensywności.
   8. Zmaksymalizuj intensywność sygnału AC, precyzyjnie dostosowując opóźnienie czasowe. Wyreguluj zwierciadło dichroiczne, aby wyśrodkować sygnał SRS na kanale AC (utrzymując kanał DC wyśrodkowany). Dostosuj fazę lock-in amplifier, aby zmaksymalizować sygnał. Zobacz Rysunek 3 dla zadowalającego sygnału.

3. Optymalizacja rozdzielczości spektralnej

UWAGA: Pompa i wiązki Stokesa docierające do próbki powinny mieć taką samą dyspersję opóźnienia grupowego (GDD), aby zmaksymalizować rozdzielczość widmową. Dyspersja zależy w dużej mierze od konfiguracji eksperymentalnej. Opisana tutaj konfiguracja eksperymentalna wykorzystuje impulsy femtosekundowe o długości fali 1040 nm i 800 nm odpowiednio jako Stokesa i pompę. Jako medium rozciągające impulsowo stosuje się pręty ze szkła krzemiennego o gęstości (H-ZF52A).

1. Włożyć 48 cm pręta szklanego o wysokiej dyspersji (H-ZF52A lub równoważne gęste szkło krzemienne) do ścieżki wiązki o długości fali 800 nm. Oszacuj GDD za pomocą Eq (1):

   

   {{}}

   UWAGA: GVD różnych materiałów szklanych przy różnych długościach fal można znaleźć w zasobie bazy danych indeksu załamania światła. Na przykład H-ZF52A ma DMC 220,40 fs²/mm przy 800 nm. Całkowite GDD wynosi 105792 fs².

2. Oblicz, ile cm dyspersyjnego pręta szklanego jest potrzebne, aby dodać go do ścieżki wiązki 1,040 nm, aby dopasować GDD pompy. Włóż odpowiednią długość dyspersyjnych prętów szklanych do ścieżki wiązki 1,040 nm, aby mniej więcej odpowiadała GDD wiązki 800 nm. Należy pamiętać, że dodanie szklanych prętów zmieni czasowe nakładanie się dwóch belek i może być konieczna regulacja opóźnienia.
3. Kalibracja rozdzielczości spektralnej
   1. Wykonaj próbkę szkiełka mikroskopowego za pomocą DMSO. Umieść szkiełko na mikroskopie i sprawdź moc wiązek wychodzących z kondensatora mikroskopu. Dostosuj odpowiednio moc, aby mieć ~40 mW każdy w sample focus.
   2. Otwórz ScanImage z MATLAB. Znajdź maksymalny sygnał SRS, skanując przez stopień opóźniający, który odpowiada 2,913 cm^-1 piku Ramana DMSO. Oszacuj pozycję stolika na podstawie poprzedniego położenia stolika ze zwiększoną długością ścieżki optycznej spowodowaną włożeniem prętów. Wyrównaj przestrzenne nakładanie się belki ze względu na niewielkie odchylenie belki podczas dodawania prętów szklanych.
   3. Zapisz hiperspektralny skan SRS, sekwencyjnie wykonując serię obrazów SRS podczas przesuwania zmotoryzowanego stolika.
      UWAGA: Zakres skanowania opóźnienia obejmuje dwa piki Ramana, odpowiadające odpowiednio 2,913 cm^-1 i 2,994 cm^-1 szczytów ramanowskich DMSO. Te dwa przejścia obserwuje się przy użyciu pompy o długości fali 800 nm i lasera Stokesa o długości fali 1040 nm.
   4. Wykreśl widma SRS roztworu DMSO za pomocą ImageJ lub MATLAB. Dopasuj duży szczyt DMSO 2,913 cm^-1 do funkcji Gaussa lub Lorentza w MATLAB, aby obliczyć pełną szerokość przy połowie maksimum (FWHM) szczytu.
      UWAGA: Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 4. Jeśli obecny jest tylko jeden szeroki pik, oznacza to, że albo rozdzielczość widmowa jest zbyt niska, aby rozróżnić dwa piki i potrzeba więcej szklanych pręcików, albo skanowany zakres był zbyt mały, aby wykryć drugi pik. Zazwyczaj akceptowalna rozdzielczość spektralna DMSO wynosi ~20-25 cm^-1, gdy używany jest pręt szklany o długości >60 cm. Niższa rozdzielczość jest często używana do obrazowania tkanek w celu wymiany na wyższe sygnały z krótszymi impulsami.
4. (OPCJONALNIE) Użyj autokorelatora lub FROG (Frequency-Resolution Optical Gating), aby określić czas trwania impulsu każdego ramienia, aby obliczyć dokładnie ilość GDD i długość prętów potrzebnych do dopasowania GDD między pompą a Stokesem.
5. Powtórz kroki 3.3.2-3.3.4 dla różnych długości prętów na belce Stokesa, aby znaleźć optymalną rozdzielczość spektralną, co oznacza, że eksperymentalnie znaleziono najlepsze dopasowanie GDD. Użyj wielu zestawów szklanych prętów o różnej długości, aby uzyskać optymalną rozdzielczość spektralną.

4. Charakterystyka sygnału do szumu (SNR)

1. Upewnij się, że krok 4.2 został wykonany po całkowitym wyrównaniu przestrzennym i czasowym.
2. Uzyskaj obraz SRS odpowiadający pikowi ramanowskiemu DMSO o wysokości 2,913 cm^-1 ramanowskim piku DMSO. Otwórz obraz w ImageJ i wybierz mały obszar na środku ramki. Użyj funkcji measure , aby obliczyć średnią i odchylenie standardowe wartości w wybranym obszarze.

3. Podziel średnią wartość wybranego obszaru przez odchylenie standardowe, aby znaleźć wartość SNR, jak w Eq (2).

   

   UWAGA: Dobry stosunek sygnału do szumu (ze stałą czasu blokady wynoszącą 4 μs) przy DMSO przy 40 mw/40 mw przy ostrości dla obu ramion wynosi >800. Niższe stężenia DMSO lub niższa moc mogą być używane do dokładniejszego oszacowania SNR, jeśli karta akwizycji danych ma ograniczoną głębię bitową.

4. Jeśli SNR jest zbyt niski, ponownie wyrównaj impulsy laserowe, aby zoptymalizować nakładanie przestrzenne, nakładanie czasowe, dopasowanie rozmiaru wiązki/kolimacji i/lub dopasowanie dyspersji. W przypadku obiektywu z kołnierzem korekcyjnym należy zoptymalizować sygnał, regulując kołnierz korekcyjny.

5. Kalibracja osi częstotliwości

UWAGA: Ten krok jest wykonywany w celu powiązania pozycji stopnia opóźnienia z zeskanowanym przejściem Ramana. Staranny dobór rozpuszczalników jest wymagany do wytworzenia odpowiedniej "linijki Ramanowskiej". DMSO jest skutecznym rozpuszczalnikiem dla wiązań CH, ponieważ ma dwa ostre piki Ramana na wysokości 2,913 cm^-1 i 2,994 cm^-1.

1. Zapisz skan hiperspektralny z zakresem etapu opóźnienia obejmującym 2,913 cm^-1 i 2,994 cm^-1 szczytów ramanowskich DMSO. Zapisz pozycje stołu montażowego odpowiadające zestawowi danych hiperspektralnego.
   UWAGA: Globalny maksymalny pik widma odpowiada DMSO 2,913 cm^-1 Przesunięcie Ramana i drugi maksymalny pik odpowiada DMSO 2,994 cm^-1.
2. Wykonaj regresję liniową dla pozycji sceny i przesunięć Ramana o 2,913 cm^-1 i 2,994 cm^-1. Korzystając z równania regresji liniowej wiążącego położenie etapu z przesunięciem Ramana, przelicz pozycje opóźnienia na odpowiednie częstotliwości Ramana.

6. Modulacja ortogonalna i obrazowanie dwukolorowe

UWAGA: Krok modulacji ortogonalnej jest konieczny tylko wtedy, gdy potrzebne jest obrazowanie dwukolorowe w czasie rzeczywistym. Schemat tego schematu pokazano na rysunku Rysunek 5. Modulacja ortogonalna wykorzystuje parę EOM napędzanych jedną czwartą częstotliwości lasera (20 MHz dla lasera 80 MHz) z przesunięciem fazowym między nimi o 90°. Ten ortogonalny krok modulacji można pominąć w przypadku jednokolorowego obrazowania SRS lub hiperspektralnego obrazowania SRS.

1. Modulacja EOM1
   1. Zainstaluj rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej (PBS2), płytę ćwierćfalową (QWP2) i drugi EOM (EOM2) na ścieżce wiązki Stokesa po pierwszym EOM. Odłącz wejście sygnału od EOM2. Podłącz wejście sygnału do EOM1 i włącz je.
   2. Moduluj wiązkę Stokesa (stałą na 1,040 nm) na 20 MHz (f₀/4), wysyłając wiązkę przez pierwszy EOM. Dostosuj nachylenie i położenie EOM1, aby upewnić się, że wiązka uderza prosto i wyśrodkowana przez kryształ EOM.
   3. Monitoruj głębokość modulacji, obserwując obie polaryzacje wychodzące z PBS1 za pomocą dwóch fotodiod i wyświetlając modulację na oscyloskopie.
   4. Dostosuj napięcie QWP1, EOM1 i fazę wejścia 20 MHz (za pomocą przesuwnika fazowego), aby zoptymalizować głębokość modulacji przesyłanej wiązki tak, aby była bliska 100%. Zobacz Rysunek 2B dla ilustracji dobrej głębokości modulacji.
2. Modulacja EOM2
   1. Odłącz EOM1 i podłącz EOM2.
   2. Wyślij wyjście wysokiego napięcia drugiego wzmacniacza o częstotliwości 20 MHz do EOM2. Dostosuj nachylenie i położenie EOM2, aby upewnić się, że wiązka uderza prosto i wyśrodkowana przez kryształ EOM.
   3. Po raz kolejny monitoruj głębokość modulacji, patrząc na obie polaryzacje wychodzące z PBS2 za pomocą oscyloskopu. Dostosuj napięcie QWP2, EOM2 i przesuwnik fazowy zgodnie z potrzebami, aby uzyskać modulację bliską 100% dla obu polaryzacji.
   4. Upewnij się, że modulacja ciągu impulsów ma przesunięcie fazowe o 90° w stosunku do pierwszej modulacji.
      UWAGA: Jeśli dwa ciągi impulsów pompy nie są ortogonalne pod kątem 90°, przesłuch między dwoma kanałami będzie problemem.
   5. Przetestuj ortogonalność modulacji, włączając i podłączając zarówno EOM1, jak i EOM2. Monitoruj obie polaryzacje dzielone przez PBS2 za pomocą oscyloskopu. Zoptymalizuj ponownie EOM1 i EOM2 indywidualnie, jeśli ciąg impulsów po drugim PBS nie przypomina Rysunek 2C.
   6. Zainstaluj 20-milimetrowy dwójłomny kryształ kwarcu (BRC) i płytkę półfalową (HWP) za EOM2. Podłącz oba EOM jednocześnie i monitoruj ciąg impulsów tak, aby przypominał Rysunek 2D.
      UWAGA: Dla ćwierkania użytego w tym eksperymencie, 20 mm BRC indukuje opóźnienie czasowe, które odpowiada przesunięciu Ramana o 80 cm^-1{. Inna długość BRC może być potrzebna, jeśli używany jest inny ćwierk.
3. Kalibracja
   1. Kalibruj system za pomocą DMSO, wykrywając sygnały z wyjścia kanału X i Y wzmacniacza lock-in (wysyłane do kanałów 2 i 3 karty akwizycji danych).
   2. Sprawdź, czy sygnały generowane przez 2,913 cm^-1 szczytują z szybszej polaryzacji i te z wolniejszej polaryzacji są bliskie 90° przesunięcia w fazie na wzmacniaczu lock-in. Jeśli tak nie jest, wyreguluj wyrównanie EOM, aż oba sygnały będą bliskie 90° przesunięcia w fazie.
   3. Po zakończeniu kalibracji znajdź pozycję opóźnienia, która sonduje przejście białka na 2,930 cm^-1 dla jednej z wiązek ortogonalnych. Upewnij się, że druga polaryzacja sonduje przejście lipidowe 2,850 cm^-1.

7. Obrazowanie SRS w trybie Epi

UWAGA: W schemacie obrazowania w trybie transmisji obiektyw skupia laser na próbce, a następnie soczewka kondensatora kieruje przesyłaną wiązkę do fotodiody w celu wykrycia blokady. W schemacie obrazowania w trybie epi światło, które jest wstecznie rozpraszane i depolaryzowane przez próbkę, jest zbierane przez obiektyw skupiający i izolowane za pomocą polaryzacyjnego rozdzielacza wiązki. Wyizolowane i rozproszone wstecznie fotony są wysyłane do fotodiody przez parę soczewek przekaźnikowych w celu wykrycia blokady. Rysunek 6 przedstawia schemat obrazowania w trybie epi.

1. Zainstaluj HWP, zanim wiązka wejdzie do mikroskopu, aby zmienić polaryzację wiązki wchodzącej do mikroskopu. Umieść PBS nad obiektywem, aby zdepolaryzowana wiązka odbita wstecznie mogła dotrzeć do detektora.
2. Użyj pary soczewek składających się z soczewki achromatycznej 75 mm i soczewki asferycznej 30 mm, aby przekazać fotony rozproszone wstecznie z tylnej apertury obiektywu do fotodetektora. Zamontuj detektor, aby zebrać światło rozproszone wstecznie kierowane przez PBS. Zainstaluj filtr, aby zablokować modulowaną wiązkę przed wejściem do detektora.
3. Umieść próbkę tkanki pod obiektywem. Ponieważ kondensator nie jest potrzebny do obrazowania w trybie epi, wyjmij go, jeśli wymagane jest więcej miejsca.
4. Obrazowanie
   1. Zablokuj wiązkę za pomocą migawki; skierować białe źródło światła na próbkę z boku; i użyj Brightfield, aby znaleźć obiektywną ostrość.
   2. Odblokuj obie wiązki i użyj wstępnie skalibrowanych pozycji opóźnienia, aby uzyskać obrazy SRS lipidów i białek z tkanki z dwóch wyjść wzmacniacza lock-in.
   3. Dostosuj wzmocnienie blokady i współczynnik pojemnika pikseli, aby uzyskać obrazy dobrej jakości.

8. Barwienie fałszywymi kolorami

1. Otwórz stos obrazów za pomocą ImageJ.
2. Wyciągnij dwa obrazy, które odpowiadają gatunkowi lipidowemu (2,850 cm^-1) i białkowemu (2,930 cm^-1), klikając prawym przyciskiem myszy na obrazie i klikając Duplicate.
3. Zmień nazwę obrazu lipidów na lipids , a obraz białka na białka.
4. Przejdź do Proces | Kalkulator obrazów i wykonaj białka subtract lipids.
5. Połącz obrazy, przechodząc do Obraz | Kolor | Scal kanały, ustawiając lipids do zielony i białka na {{TAG_921}blue. Otwórz narzędzie image channels (Obraz | Kolor | Narzędzie kanałów) i dostosuj jasność i kontrast (Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast).
6. Dostosuj jasność i kontrast dla każdego kanału za pomocą narzędzia channels . W przypadku kanału lipidowego dostosuj kontrast, aż cechy komórkowe staną się ciemne. W przypadku kanału białkowego dostosuj kontrast, aż cechy komórkowe staną się niebieskie. Przekonwertuj obraz zielono-niebieski scalonego kanału na obraz RGB, przechodząc do Image | Rodzaj | Kolor RGB. Eksportuj ten obraz przez Plik | Zapisz jako | Tiff.
   UWAGA: W przypadku fałszywego barwienia H&E, schemat kolorów pokazuje różową cytoplazmę, podczas gdy jądra są ciemnoniebiesko-fioletowe.
7. Pobierz skrypt HE.m MATLAB z zasobu fałszywego skryptu barwienia H&E w Tabela materiałów.
8. Uruchom skrypt HE.m w programie MATLAB. Wybierz wyeksportowany obraz RGB z poprzedniego kroku, aby wygenerować sztucznie wybarwiony obraz H&E.
9. (OPCJONALNIE) Normalizacja intensywności obrazu w przypadku obrazowania o dużym polu widzenia, ponieważ obraz wydaje się ciemniejszy na obrzeżach niż w środku.
   1. Aby przeprowadzić normalizację pól obrazów, uśrednij jak najwięcej obrazów. Następnie usuń cechy intensywności za pomocą ImageJ (Process | Filtry | Rozmycie gaussowskie | Promień=50).
   2. Zmierz maksymalną intensywność rozmytego obrazu (Ctrl+M). Podziel rozmyty obraz przez maksymalną intensywność (Process | Matematyka | Dzielić). Podziel surowy obraz SRS przez rozmyty obraz (Process | Obraz | Kalkulator).

Wyniki

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Obiektyw achromatyczny 100 mm	THORLABS	AC254-100-B	Szerokopasmowy, 650 - 1,050 nm, achromatyczny obiektyw o ogniskowej, 100 mm
20 MHz filtr pasmowoprzepustowy	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19,2 - 23,6 MHz, 50 Ω
Obiektyw achromatyczny 200 mm	THORLABS	AC254-200-B	Szerokopasmowy, 650 - 1,050 nm, ogniskowa obiektywu achromatycznego, 200 mm
Achromatyczna półfala	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Szerokopasmowa półfala
Achromatyczna ćwierćfalowa płyta	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Szerokopasmowa ćwiartka falowa
Próbnik wiązki	THORLABS	BSN11	10:90 Rozdzielacz wiązki płytowej
Zwierciadło dichroiczne	THORLABS	DMSP1000	Można stosować inne dichroiki o środkowej długości fali około 1,000 nm.
DMSO (sulfotlenek dimetylu)	Sigma Aldrich	472301	Rozpuszczalnik do kalibracji przesunięcia Ramana. Można stosować inne rozpuszczalniki o znanych pikach Ramana.
Elektrooptyczny modulator amplitudy	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Do modulacji ortogonalnej i obrazowania dwukanałowego potrzebne są dwie EOM. Zalecana jest wersja rezonansowa, aby można było zastosować niższe napięcie sterujące.
Fałszywy skrypt barwienia H&E	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Laboratorium Badań Impulsów	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, do generowania częstotliwości sterowania EOM i odniesienia do blokady
Szybka fotodioda	THORLABS	DET10A2	Si Detektor, 1 ns Czas narastania
Dzielnik częstotliwości	PRL-220A	Laboratorium Badań Impulsów	Częstotliwość TTL Dzielnik (f/2, f/4, f/8, f/16), do generowania 20MHz z wyjścia laserowego.
Pręty szklane o wysokiej dyspersji	Union Optic	CYLROD01	Wysokodyspersyjna soczewka prętowa H-ZF52A 120 mm, SF11 soczewka prętowa 100 mm
Insight DS+	Newport		System laserowy zdolny do wysyłania dwóch zsynchronizowanych laserów impulsowych (jedna stała wiązka o wartości 1, 040 nm i jedna wiązka przestrajalna, w zakresie 680-1,300 nm) z częstotliwością powtarzania 80 MHz.
Wzmacniacz typu lock-in	Liquid Instruments	Moku Lab	Wzmacniacz typu lock-in do ekstrakcji sygnału SRS z fotodiody. Można również użyć instrumentu Zurich HF2LI lub podobnego instrumentu.
Lustra	THORLABS	BB05-E03-10	Szerokopasmowe zwierciadło dielektryczne, 750 - 1,100 nm. Można również użyć srebrnych luster.
Zmotoryzowany stopień opóźniający	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Stopień opóźnienia do precyzyjnej kontroli czasowego nakładania się pompy i laserów Stokesa. Każdy inny zmotoryzowany etap powinien działać.
Kondensor zanurzeniowy olejowy	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Można stosować inne skraplacze z NA>1.2.
Oscyloskop	Tektronix	TDS7054	Każdy inny oscyloskop o paśmie 400 MHz lub wyższym powinien działać.
Przesuwnik fazy	SigaTek	SF50A2	Do przesunięcia fazy częstotliwości modulacji
Fotodioda	Hamamatsu Corp	S3994-01	Krzemowa dioda PIN o dużej powierzchni (10 x 10 cm2). Można stosować inne diody o dużej powierzchni i niskiej pojemności.
Rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej	Union Optic	PBS9025-620-1000	Szerokopasmowy polaryzacyjny rozdzielacz wiązki
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Światło odblaskowe	Edmund Optics	34-408	BBAR Pryzmat kątowy. Można zastosować inne pryzmaty lub retroreflektor.
Wzmacniacz mocy RF	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Blok wzmocnienia, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	Użyliśmy zestawu luster 5mm ze srebrną powłoką
ScanImage	Vidrio	Oprogramowanie sterujące laserowym mikroskopem skaningowym
Filtr krótkoprzepustowy	THORLABS	FESH1000	25,0 mm Premium Filtr krótkoprzepustowy, długość fali granicznej: 1,000 nm. Do skutecznego tłumienia Stokesa mogą być konieczne dwa filtry.
Mikroskop pionowy	Nikon	Eclipse FN1	Można użyć dowolnej innej ramy mikroskopu. Jeśli dostępny jest laserowy mikroskop skaningowy, można go używać bezpośrednio. W przeciwnym razie do mikroskopu trzeba było dodać skaner galvo i soczewkę skanującą.
Cel zanurzenia w wodzie	Olympus	XLPLN25XWMP2	Wielofotonowy obiektyw 25X ma NA 1,05. Można zastosować inne podobne cele.

{{TAG_ 49}}Scan Mirrors{{}} }{{TAG_ 284}}ScanImage Basic