Mikroskopia dwufotonowa astrocytów i neuronów pobudzających w oczyszczonej tkance hipokampa myszy

Streszczenie

Źródło: Refaeli, R., i wsp., Badanie interakcji przestrzennej między astrocytami a neuronami w oczyszczonych mózgach. J. Vis. Exp. (2022)

Film przedstawia przygotowanie komora i neuroobrazowanie oczyszczonej tkanki hipokampa myszy przy użyciu mikroskopii dwufotonowej w celu wizualizacji interakcji przestrzennych między fluorescencyjnie znakowanymi astrocytami a neuronami pobudzającymi.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Przygotowanie komory

UWAGA: Każda próbka wymaga szkiełka z komorą obrazowania, w której zostanie umieszczona próbka.

1. Umieść próbkę na środku szkiełka.
2. Za pomocą pistoletu do klejenia na gorąco utwórz ścianki na krawędziach szkiełka, prawie tak wysokie jak tkanka. Upewnij się, że zostawiłeś niewielką szczelinę (około 5 mm) w jednym z rogów (Rysunek 1A, B).
3. Nałóż 1-2 krople roztworu dopasowującego współczynnik załamania światła lub RIMS na próbkę, aby utrzymać wilgotność górnej powierzchni i zapobiec tworzeniu się pęcherzyków między szkiełkiem nakrywkowym a tkanką.
4. Natychmiast po nałożeniu kropli RIMS (Refractive Index Matching solution) dodaj ostatnią warstwę gorącego kleju do ścianek (tak, aby osiągnęły wysokość mózgu/plasterka) i natychmiast przejdź (gdy gorący klej jest jeszcze płynny) do kroku 1,5.
5. Uszczelnij wierzch szkiełkiem nakrywkowym, umieszczając go jak najbardziej równomiernie na wierzchu jeszcze ciepłej warstwy gorącego kleju (Rysunek 1C).
6. Napełnij komorę RIMS przez szczelinę pozostawioną w ściankach gorącego kleju (Rysunek 1D, E).
7. Zamknij szczelinę gorącym klejem. Nie zostawiaj powietrza w środku (Rysunek 1F).
8. Jeśli ścianki gorącego kleju wystają poza granice prowadnicy, przytnij krawędzie przedłużające (Rysunek 1G).
9. Jeśli obiektyw używany do obrazowania jest zanurzony, dodaj kolejne 2-3 mm kleju do ścianek nad szkiełkiem nakrywkowym, aby roztwór zanurzeniowy trwał dłużej (Rysunek 1H).

Wyniki

Materiały