$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Sekcja przesiewowa pod kątem obecności blaszek barwionych metoksy-X04
- Za pomocą stereotaktycznego atlasu mózgu myszy wybierz sekcje mózgu zawierające obszar zainteresowania, na przykład hipokamp CA1, jak użyto w niniejszym przykładzie. Umieść każdą sekcję w studzience w 24-dołkowej płytce hodowlanej zawierającej wystarczającą ilość roztworu krioprotektantu, aby zapobiec wysychaniu skrawków.
- Zbadaj kolejno każdą sekcję, aby uniknąć wysuszenia skrawków, stosując następującą procedurę:
- Dodaj kroplę soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do szkiełka mikroskopowego za pomocą jednorazowej pipety i umieść sekcję na kropli.
- Zbadaj przekrój pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby zidentyfikować obszary zawierające płytki Aβ znakowane metoksy-X04.
Uwaga: metoksy-X04 można łatwo zwizualizować za pomocą fluorescencyjnego filtra ultrafioletowego (UV) (wzbudzenie 340 - 380 nm).
- Rób obrazy obszarów zainteresowania (ROI) w jasnym polu, a także w trybie fluorescencji bez przesuwania stolika mikroskopu, ponieważ każdy obraz musi pokazywać ten sam obszar w obu polach, aby skorelować obecność blaszek bezpośrednio z obszarem strukturalnym przekroju tkanki.
- Zapisz i nazwij zrobione zdjęcia zgodnie z numerem zwierzęcia. Zapisz również numer studni na tabliczce i pole wykonanych zdjęć. Na przykład np.: 9978A1B; Numer zwierzęcia: 9978; Numer studni: A1; Pole: Jasne. Po zakończeniu obrazowania umieść sekcję z powrotem w wyznaczonym dołku.
Uwaga: Na końcu, dla każdej badanej sekcji, uzyskuje się dwa obrazy, jedno w jasnym polu, a drugie w polu UV. - Otwórz dwa obrazy o tym samym ROI (jeden w jasnym polu, a drugi w polu UV) na obrazie J i za pomocą wtyczki MosaicJ wyrównaj krawędzie dwóch obrazów i zapisz wyrównany i połączony obraz zgodnie z numerem studni, z którego pochodzi.
- Zapisz zdjęcie w osobnym folderze z numerem konkretnego zwierzęcia. Połącz obrazy, aby zidentyfikować i zlokalizować blaszki w sekcji tkanki i uzyskać pełny widok całej sekcji w dwóch różnych polach (jasnym i UV).
- Po zakończeniu procesu przesiewowego badane skrawki należy przechowywać w temperaturze -20 °C na 24-dołkowej płytce hodowlanej zawierającej krioprotektant do czasu przeprowadzenia barwienia immunologicznego lub dalszego przetwarzania.