Wizualizacja skrzepliny mózgowej u myszy za pomocą obrazowania metodą mikrotomografii komputerowej

Streszczenie

Źródło: Kim, D., et. al. Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i mikrotomografia komputerowa do bezpośredniej wizualizacji zakrzepowej choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film przedstawia wizualizację skrzepliny mózgowej u myszy za pomocą obrazowania mikrotomografii komputerowej (mikro-CT). Mysi model zakrzepliny mózgowej jest wstrzykiwany z nanocząstkami złota ukierunkowanymi na fibrynę, działającymi jako środek kontrastujący. Mysz jest umieszczana na łóżku mikrotomografu komputerowego, a obrazy są pozyskiwane pod różnymi kątami. Za pomocą odpowiedniego oprogramowania obrazy są rekonstruowane i przetwarzane.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie egzogennie utworzonego skrzepu znakowanego markerem fluorescencyjnym (ryc. 1)

1. Znieczulij mysz w komorze indukcyjnej za pomocą 3% izofluranu zmieszanego z 30% tlenu (1,5 l/min 100% tlenu). Zapewnij odpowiednią głębokość znieczulenia, obserwując napięcie mięśniowe i potwierdzając brak odruchu szczypania palca u nogi.
2. Umieść zwierzę na sterylnej serwicie w pozycji leżącej i trzymaj je pod narkozą za pomocą maski inhalacyjnej i 2% izofluranu zmieszanego z 30% tlenem. Wykonaj następujące procedury, stosując techniki aseptyczne i sterylne fartuchy/maski/rękawiczki/instrumenty. Utrzymuj sterylne warunki, czyszcząc i odkażając obszar eksperymentalny 70% alkoholem przed i po zabiegach.
3. Zbierz około 300 ~ 1,000 μl krwi tętniczej po nakłuciu serca. Wymieszaj 70 μl krwi pełnej z 30 μl sondy C15 (stężenie 20 μmol/l), sondą fluorescencyjną Cy5.5 wrażliwą na aktywność sieciowania fibryny aktywowanego enzymu krzepnięcia czynnika XIII (FXIIIa), aby fluorescencyjnie oznaczyć skrzep (Rysunek 1A). Mieszaninę krwi należy wstrzyknąć za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml (igła o rozmiarze 23) do rurki polietylenowej o długości 20 cm (PE-50, średnica wewnętrzna 0,58 mm). Rurki PE muszą być wysterylizowane (lub certyfikowane przez producenta jako sterylne), a skrzepy muszą być przygotowane aseptycznie w kapturze do hodowli tkankowych.
4. Zweryfikuj śmierć zwierzęcia, obserwując brak oddychania i tętna serca.
5. Pozostawić probówkę z krwią w temperaturze pokojowej na 2 godziny, a następnie w temperaturze 4 °C na 22 godziny i wykonać następujące procedury, jak opisano wcześniej.
6. Pokrój rurkę zawierającą skrzeplinę na kawałki o długości 1,5 cm. Za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml wypełnionej solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), wyprowadzić skrzeplinę na 6-dołkową płytkę zawierającą PBS, delikatnie wstrzykując PBS do każdego kawałka probówki. Umyj skrzepliny trzykrotnie PBS (Rysunek 1B).
7. Załaduj dystalną końcową część rurki PE-10 o długości 15 cm (średnica wewnętrzna 0,28 mm) skrzepliną o długości 1,5 cm, ostrożnie rysując przemytą skrzeplinę, unikając pęcherzyków powietrza, za pomocą wypełnionej solą fizjologiczną strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 30, którą wkłada się do bliższego końca probówki.
8. Połącz rurkę PE-10 obciążoną skrzepliną z rurką PE-50 o długości 3 cm (średnica wewnętrzna 0,58 mm) zmodyfikowaną tak, aby miała zwężający się koniec (ID 200 μm), który zostanie umieszczony w obszarze bifurkacji tętnicy środkowej mózgu (MCA) – tętnicy mózgowej przedniej (ACA) tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) w mysim modelu udaru zatorowego (Rysunek 1C).

2. Modelowanie mysiego modelu udaru zakrzepowo-zatorowego (ryc. 2)

1. Znieczulenie innej myszy do głaskania w komorze indukcyjnej za pomocą 3% izofluranu zmieszanego z 30% tlenem (1,5 l/min). Meloksykam (5 mg/kg) należy wstrzyknąć podskórnie w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego. Zapewnij odpowiednią głębokość znieczulenia, obserwując napięcie mięśniowe i potwierdzając brak odruchu szczypania palca u nogi.
2. Nałóż niewielką ilość maści weterynaryjnej na każde oko, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Wykonaj następujące zabiegi chirurgiczne przy użyciu technik aseptycznych i sterylnych fartuchów/masek/rękawiczek/narzędzi. Utrzymuj sterylne warunki, czyszcząc i odkażając obszar operacyjny 70% alkoholem przed, w trakcie i po operacji.
3. Przesuń mysz na stół operacyjny. Umieść zwierzę na sterylnej serwicie w pozycji leżącej i utrzymuj je pod narkozą za pomocą maski inhalacyjnej i 2% izofluranu. Następnie należy ustawić temperaturę ciała na poziomie 36,5 °C za pomocą koca homeotermicznego z informacją zwrotną z termometru doodbytniczego.
4. Po chirurgicznym przygotowaniu z użyciem betadyny i 70% alkoholu, wykonaj 1 cm pionowe nacięcie za pomocą skalpela na skórze głowy między lewym uchem a okiem. Przyklej dystalny koniec światłowodu laserowego przepływomierza dopplerowskiego do odsłoniętej lewej powierzchni kości skroniowej (1 mm po lewej i 4 mm poniżej bregmy). Następnie rozpocznij monitorowanie przepływu dopplerowskiego (Rysunek 2A).
5. Połóż zwierzę. Wyprostuj szyję, pociągając za górny przedni ząb sznurkiem przymocowanym do szpilki i ogol obszar szyi. Następnie wykonaj 3 cm pionowe nacięcie linii środkowej, rozłóż je i odsłoń lewy obszar bańki szyjnej, preparując okołonaczyniowe tkanki miękkie. Uważaj, aby nie uszkodzić nerwu błędnego.
6. Podwiązać lewą bliższą tętnicę szyjną wspólną (CCA) za pomocą sterylnego czarnego jedwabnego szwu 6-0 i podwiązać lewą ICA i lewą tętnicę skrzydłowo-podniebienną (PPA) za pomocą sterylnych czarnych jedwabnych szwów 7-0.
7. Kauteryzuj lewą górną tętnicę tarczycową, która jest gałęzią lewej tętnicy szyjnej zewnętrznej, za pomocą monopolarnej elektrycznej kauteryzacji i podwiązuj lewą bliższą tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) luźno i bardziej dystalnie za pomocą sterylnych czarnych jedwabnych szwów 7-0.
8. Za pomocą mikronożyczek wykonaj mały otwór (o średnicy około 0,2 ~ 0,25 μm) między podwiązanymi miejscami ECA.
9. Wprowadzić cewnik zawierający skrzeplinę do otworu w ECA, jednocześnie poluzowując proksymalne podwiązanie ECA. Ponownie zaciśnij bliższe podwiązanie ECA po wsunięciu cewnika do CCA, aby zacisnąć cewnik na miejscu.
10. Kauteryzować, aby przeciąć dystalną część ECA, która jest dystalna w stosunku do dystalnego miejsca podwiązania, i obrócić wolną proksymalną ECA zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby wyrównać ją w kierunku ICA podczas wyjmowania cewnika z CCA. Następnie należy przesunąć cewnik o około 9 mm do obszaru rozwidlenia MCA-ACA dystalnego ICA natychmiast po poluzowaniu podwiązania ICA. Następnie dokręć podwiązanie ICA.
11. Umieścić skrzeplinę w obszarze rozwidlenia, delikatnie naciskając strzykawkę o pojemności 1 ml w celu wstrzyknięcia skrzepliny. Sprawdź spadek dopplerowskiego przepływu krwi w mózgu (CBF), który powinien być obniżony o 30% lub mniej w porównaniu z wartością wyjściową, jeśli skrzeplina skutecznie zamknęła naczynie (Rysunek 2B).
12. Usunąć cewnik i natychmiast i mocno podwiązać miejsce proksymalne ECA. Ponadto należy rozciągnąć CCA i PPA.
13. Zamknij miejsce nacięcia za pomocą jedwabnych szwów 6-0. Przerwij znieczulenie po kontynuowaniu monitorowania dopplerowskiego przez wymagany okres czasu (w tym przypadku przez 30 minut po wstrzyknięciu skrzepliny). Włóż mysz z powrotem do pustej klatki i utrzymuj ją w cieple za pomocą lampy grzewczej. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie uzyska wystarczającej świadomości, aby utrzymać leżący mostek.

3. In Vivo Obrazowanie mikrotomografii skrzepliny mózgowej (ryc. 3)

1. Ponownie znieczulij mysz 2% izofluranem, jak opisano w kroku 2.1, w określonym wcześniej punkcie czasowym (tutaj, 1 godzina) po wystąpieniu udaru zatorowego z powodu umieszczenia skrzepliny w tętnicy mózgowej. Zapewnij odpowiednią głębokość znieczulenia, potwierdzając brak odruchu szczypania palca u nogi. Nałóż niewielką ilość maści weterynaryjnej na każde oko, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
2. Zawiesić nanocząstki złota ukierunkowane na fibrynę (fib-GC-AuNP4) w stężeniu 10 mg Au/ml w 10 mM PBS i sonikować środek do obrazowania skrzepliny przez 30 minut, aby zapewnić rozpuszczenie i dyspersję nanocząstek. Wstrzyknąć 300 μl fib-GC-AuNP (10 mg/ml) do żyły prącia.
3. Umieść zwierzę na łóżku maszyny do mikrotomografii komputerowej i wyprostuj szyję, pociągając górny przedni ząb za pomocą sznurka przymocowanego do szpilki, aby zmniejszyć artefakty ruchu.
4. Po 5 minutach od wstrzyknięcia fib-GC-AuNP należy rozpocząć uzyskiwanie obrazów mózgu za pomocą mikrotomografii komputerowej. Dla opisanych tu eksperymentów należy zastosować następujące parametry obrazowania: 65 kVp, 60 μA, 26,7 x 26,7 x 27,9 mm³ pole widzenia, 0,053 x 0,053 x 0,054 mm³ rozmiar woksela, 100 milisekund na klatkę, jedno uśrednianie, 360 widoków, macierz rekonstrukcyjna 512 x 512, 600 warstw, Czas skanowania: 64 sekundy.
5. Umieść mysz z powrotem w pustej klatce i utrzymuj ją w cieple za pomocą lampy grzewczej. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie uzyska wystarczającej świadomości, aby utrzymać leżący mostek.
6. Przekształć surowe dane obrazu do formatu DICOM (Digital Imaging and Communications in Medicine) za pomocą polecenia 'Start' panelu "Rekonstrukcja" w pakiecie oprogramowania zainstalowanym na skanerze mikro-CT.
7. W przypadku analiz ilościowych obrazów (w kroku 6) przekształć dane DICOM do formatu TIFF za pomocą dostępnego na rynku pakietu oprogramowania zgodnie z instrukcjami producenta.
8. Do analiz jakościowych, a także analiz ilościowych w prostszy i szybszy sposób, należy skorzystać z pakietu oprogramowania i oryginalnych obrazów o grubości 0,054 mm w formacie DICOM do wygenerowania nowego zestawu obrazów osiowych i koronalnych renderowanych tak, aby miały grubość 1 lub 2 mm (w tym przypadku 2 mm), jak poniżej.
   1. Wybierz folder DICOM w drzewie 'Data Source', kliknij prawym przyciskiem myszy i zaimportuj folder do 'MasterDB' lub 'PrivateDB.'
   2. Kliknij "MasterDB" lub "PrivateDB" w drzewie "Źródło danych" i wybierz zaimportowany folder. Po kliknięciu zakładki "3D" w skrajnym lewym panelu, gdy pojawi się okno "Opcje ładowania", naciśnij "OK", aby zaimportować sekwencję obrazów w folderze jako stos.
   3. Zmień reprezentację obrazu na format projekcji maksymalnej intensywności (MIP), klikając słowo "MRP" w oknach obrazu osiowego i koronalnego, a następnie wybierając "MIP" w menu podręcznym. Następnie zmień grubość obrazu na 2 mm po kliknięciu 'TH : 0 [mm]' w tym samym oknie.
   4. Korzystając z paska nawigatora 3D o szerokości 2 mm, który pozwala na eksplorację stosu obrazów i krojenie go pod odpowiednim kątem i w odpowiednim miejscu, przygotuj obraz przekroju osiowego o grubości 2 mm z pełnym pokryciem okręgu Willisa (COW), w którym znajdują się skrzepliny. Kliknij przycisk przechwytywania (ikona aparatu) w panelu 'Output'. Zapisz obraz w formacie TIFF.
9. Następnie przygotuj pięć obrazów przekroju koronalnego o grubości 2 mm, które obejmują ciągłość od płata czołowego do móżdżku.
   1. Najpierw przygotuj drugi plasterek, ostrożnie wyrównując pasek nawigatora na obrazie osiowym, tak aby obraz koronalny mógł jak najlepiej uwidocznić skrzepliny MCA-ACA.

Następnie przygotuj pozostałe cztery plasterki w ciągły sposób. Kliknij przycisk przechwytywania (ikona aparatu) w panelu 'Output'. Zapisz obrazy w formacie TIFF.

Wyniki

Rycina 1: Przegląd przygotowania znakowanego fluorescencyjnie skrzepu krwi. (A) Mieszanie świeżej krwi pełnej z sondą fluorescencyjną bliskiej podczerwieni (NIRF) Cy5,5 (C15), która jest kowalencyjnie połączona z niciami fibryny skrzepliny p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Maszyny
microCT	NanoFocusRay, JeonJu, Korea	NFR Polaris-G90
Laserowy przepływomierz dopplerowski	Perimed, Sztokholm, Szwecja	System PeriFlux Mikroskop chirurgiczny 5000
	Leica Microsystems, Seul, Korea	EZ4HD
	PerkinElmer, Massachusetts, USA
Sterowanie NFR	NanoFocusRay, JeonJu, Korea	Oprogramowanie sterujące NFR Polaris-G90	microCT
Lucion	Infinitt, Seul, Korea	Oprogramowanie do renderowania 3D	Lucion
Wykres laboratoryjny 7	ADInstruments, Kolorado, USA	Wykres laboratoryjny 7	rCBF
Oprogramowanie Image J	Wanye Rasband, NIH, USA	Analiza obrazowania	1.49d
Urządzenia/instrumenty
Pompa infuzyjna	Harvard, Massachusetts, USA	pompa 22( 55-2226)
Koc homeotermiczny	Panlab, Barcelona, Hiszpania	HB101
Kauteryzacja kieszonkowa	Daejong, Seul, Korea	DJE-39
Matryca mózgu	Ted pella, CA, USA	15003	o przekroju koronalnym
	Natsume, Tokio, Japonia	SP-45(PE-50)	ID 0,58 mm średnica zewnętrzna 0,96 mm
rurka	PE-10Natsume, Tokio, Japonia	SP-10 (PE-10)	ID 0,28 mm OD 0,61 mm
30 mm igła	sungshim-medical, Seul, Korea
Strzykawka	CPL-medical, Ansan, Korea		1 i 3 cc
	Gauze Panamedic, Cheonan, Korea
Tape	Scotch, Seul, Korea	3M-810
Micro kleszcze	Fine Science Tools, Vancouver, Kanada	11253-27	Dumont #L5
Micro scissor	Fine Science Tools, Vancouver, Kanada	15000-03	Vannas spring
Scissor	Fine Science Tools, Vancouver, Kanada	14084-08	8,5 cm
Czarny jedwabny szew	Ailee, Busan, Korea	SK6071, SK728	Odczynniki 6-0 i 7-0
Meloxicam	Yuhan, Seul, Korea
Maść weterynaryjna	Novartis, Bazylea, Szwajcaria
10% powidon-jod (betadyna)	Firson, Cheon-an, Korea
Chlorek żelaza	Sigma, Missouri, Stany Zjednoczone	157740-5G
TTC	Amresco, Ohio, USA	0765-100g
Izofluran	Hana-Pham, Gyeonggi, Korea	Ifran	100 mL
PBS	Welgene, Daegu, Korea	LB001-02	500 mL
Nanocząstki			Synteza
Sól fizjologiczna	Daihan Pham, Seul, Korea	48N3AF3	20 mL

Aparat do znieczulenia wziewnego Oprogramowanie XGI-8 rurka PE-50 złota