Zapis i barwienie Juxtacellular w celu precyzyjnego mapowania aktywności neuronalnej u obudzonego szczura

Streszczenie

Źródło: Moore, J. D., et al. Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restricted Rats. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film pokazuje metodę zestawiania nagrań komórkowych i barwienia u skrępowanego, przytomnego szczura. Zabieg polega na rejestrowaniu sygnałów z neuronów i wstrzykiwaniu barwnika w celu precyzyjnej lokalizacji miejsca zapisu. Technika ta pozwala na dokładne odwzorowanie aktywności neuronalnej na anatomiczną strukturę mózgu.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Monitorowanie komórkowe jednostek neuronalnych

1. Pociągnij kwarcową rurkę kapilarną na laserowym ściągaczu do mikropipet dwutlenku węgla (patrz rozdział Materiały) o średnicy końcówki mniejszej niż 1 μm (Rysunek 2A).
   UWAGA: Parametry ogrzewania będą się różnić w zależności od konkretnego instrumentu, a wymagana średnica szyjki będzie się różnić w zależności od interesującej nas struktury mózgu. W przypadku nagrań we wzgórzu szczura mikropipety mają szyjki w zakresie od 5 do 7 mm.
2. Zamocuj pipetę na miejscu pod mikroskopem z kontrastem różnicowym (DIC) wyposażonym w obiektywy o dużej odległości roboczej. Użyj plasteliny, aby przytrzymać pipetę na miejscu na stoliku mikroskopu.
3. Powoli przesuń szklany blok (o grubości 0,5 - 1 cm; kawałek szkła używany do robienia noży ultra-mikrotomowych jest wygodny) w pole view za pomocą końcówki pipety. Za pomocą mikromanipulatora stolika delikatnie przyłóż końcówkę pipety do szklanki, powodując jej pęknięcie. Powtarzaj tę czynność w razie potrzeby, aż średnica zewnętrzna końcówki pipety będzie wynosić od 1 do 3 μm (Rysunek 2B, C). Upewnij się, że te mikropipety mają impedancję w zakresie około 5-15 MΩ.
4. Przygotować sól fizjologiczną zewnątrzkomórkową (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 5 mM HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy), pH 7,2 z NaOH) i dodać 2% (w/v) Chicago Sky Blue. Napełnić tylny koniec pipety roztworem za pomocą strzykawki z igłą o sile 30 G lub mniejszej. Alternatywnie, w przypadku znakowania jednokomórkowego w zestawieniu, dodaj 2% (w/v) neurobiotyny lub biotynylowanej aminy dekstranu (BDA-3000 lub BDA-10000) do roztworu soli fizjologicznej zamiast Chicago Sky Blue.
5. Umieść szczura w skarpetce z tkaniny wewnątrz sztywnej rurki na odpowiednim przyrządzie doświadczalnym (ryc. 1). Po zabiegu należy odczekać co najmniej 72 godziny przed umieszczeniem zwierzęcia na przyrządzie zagłówka. Zaciśnij sznurek wokół górnej części mostka, a nie na szyi, aby uniknąć niedrożności dróg oddechowych. Jeśli oddychanie wydaje się być utrudnione lub utrudnione, poluzuj sznurek lub przesuń go do tyłu. Wykonaj tę procedurę, gdy szczur jest czujny.
6. Przymocuj płytkę krępującą głowę szczura do odpowiedniego elementu przyrządu. W tym celu należy najpierw przypiąć płytę zagłówka, a następnie zabezpieczyć ją śrubą 4-40. Pamiętaj, aby poczekać, aż zwierzę się uspokoi, aby uniknąć nadmiernego momentu obrotowego na głowę. Następnie umieść nakrętkę 8-32 na śrubie przytrzymującej głowę, która jest wszczepiona szczurowi. Następnie wkręć gwintowany pręt ze stali nierdzewnej do śruby łba. Przymocować pręt do eksperymentalnego przyrządu w taki sposób, aby można go było zacisnąć na miejscu (Rysunek 1).
   UWAGA: Zabezpieczenie zwierzęcia śrubą głowicy oraz płytą zagłówka minimalizuje zginanie aparatu i poprawia stabilność zapisu. W większości przypadków nagrywanie można rozpocząć w pierwszym dniu, w którym zwierzę ma skrępowaną głowę. Jeśli jednak zwierzę nadmiernie się wierci lub wokalizuje, przed rozpoczęciem jakichkolwiek nagrań należy zapewnić jednodniowy trening przyzwyczajania do zagłówków. W takim przypadku pozostaw zwierzę na przyrządzie na 15 minut, a następnie umieść je z powrotem w klatce. Powtórz ten krok następnego dnia i kontynuuj działanie protokołu.
7. Otwórz komorę nagrywania i usuń żel silikonowy. Jeśli tkanka odrosła w kraniotomii, wyczyść ją za pomocą cienkich kleszczy.
8. Podłącz pipetę do zmotoryzowanego mikromanipulatora i podłącz przedwzmacniacz stopnia głównego.
   UWAGA: W niniejszej demonstracji mały obwód przekaźnikowy na stopniu głównym przełącza się między przewodami prowadzącymi wzmacniacza a zewnętrznym źródłem prądu o wysokiej zgodności (Rysunek 3A-C). Należy pamiętać, że niektóre wzmacniacze mają odpowiednie wbudowane źródło o wysokiej zgodności.
9. Za pomocą zmotoryzowanego mikromanipulatora przesunąć końcówkę pipety do stereotaktycznego znaku w komorze nagrywającej. Zanotuj współrzędne tej lokalizacji. Uważaj, aby nie złamać końcówki pipety na czaszce.
10. Przesunąć pipetę do żądanego miejsca rejestracji w osi przednio-tylnej i przyśrodkowej. Następnie przesunąć pipetę brzusznie przez oponę twardą, aż znajdzie się około 500 μm grzbietowo do zamierzonego miejsca zapisu.
11. Powoli przesuwaj pipetę, nasłuchując na monitorze audio impulsów o wzmocnionym napięciu zarejestrowanym między końcówką pipety a przewodem odniesienia. Po zidentyfikowaniu impulsów należy kontynuować przesuwanie pipety w zakresie 0-100 μm, aż do momentu zaobserwowania dodatnich odchyleń napięcia większych niż około 500 μV.
    UWAGA: W takim przypadku rezystancja elektrody wzrośnie o współczynnik około 1,5-10.
12. Nagrywanie powinno rozpocząć się po odizolowaniu jednostki, wraz ze wszystkimi innymi interesującymi ją pomiarami behawioralnymi i fizjologicznymi. W niniejszej demonstracji samodzielnie wygenerowane ruchy wibrysów są monitorowane za pomocą szybkiej wideografii (patrz sekcja Materiały).
13. Aby oznaczyć miejsce nagrywania, przełącz przewody elektrody, aby podłączyć je do źródła prądu. Można to zrobić na kilka sposobów: za pomocą obwodu przekaźnikowego (Rysunek 3A-C), wbudowanego źródła prądu we wzmacniaczu lub ręcznie (Rysunek 3D). Przepuść -4 μA z 2-sekundowymi impulsami w 50% cyklu pracy przez 4 minuty, aby jonoforetycznie wstrzyknąć Chicago Sky Blue przez pipetę.
14. Zabić i poddać zwierzę perfuzji po kilku procedurach etykietowania zgodnie ze standardową praktyką. W razie potrzeby należy przeciąć mózg i przeciwbarwić, aby zidentyfikować anatomiczną lokalizację miejsca nagrania. Przeciwbarwić tkankę pod kątem reaktywności oksydazy cytochromowej. Alternatywnie, zidentyfikuj osady Chicago Sky Blue za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
    UWAGA: Aby dokładnie rozróżnić różne oznakowane jednostki, ważne jest, aby wszystkie etykiety zostały wykonane tą samą pipetą tego samego dnia, bez odkręcania pipety między etykietami. W tym przypadku miejsca rejestracji można rozróżnić na podstawie ich względnych lokalizacji w histologii post-hoc, wraz z zanotowanymi współrzędnymi manipulatora każdego miejsca. Aby uzyskać jednoznaczną identyfikację, oznacz etykiety w odległości co najmniej 200 μm od siebie i nie więcej niż 3-5 etykiet na region mózgu.

Wyniki

Rysunek 1: Przyrząd eksperymentalny. Schemat szczura w mechanicznym przyrządzie do eksperymentów monitorowania elektrofizjologicznego i behawioralnego. Przyrząd wykorzystuje pręt i płytkę

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ketaset (Ketamine HCl)	Fort Dodge	N/A
Anased (roztwór ksylazyny)	Lloyd Laboratories	N/A
Betadyne (Powidon-jod)	CVS Pharmacy	269281
Loctite 495	Grainger Industrial Supply	4KL86	20-40 cp cyjanoakrylan
Vetbond	3M	1469SB
Grip cement w proszku	Dentsply Intl	675571	Na podstawę komory nagraniowej
Grip cement liquid	Dentsply Intl	675572	Na podstawę komory nagraniowej
Żel silikonowy	Dow Corning	Mar-80
Proszek akrylowy do naprawy protez strumieniowych	Lang Dental Manufacturing Co.	Nie dotyczy	Do mocowania zagłówka do czaszki
Ortho-Jet Szybko utwardzająca się ortodontyczna żywica akrylowa w płynie	Lang Dental Manufacturing Co.	Nie dotyczy Do	mocowania aparatu zagłówkowego do czaszki
Chicago sky blue	Sigma	C8679
Paraformaldehyd	Sigma	158127	Do perfuzji i utrwalania tkanek
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma	P3813	Do perfuzji i utrwalania tkanek
Cytochrom C	Sigma	C2506
Diaminoferydyna	Sigma	D5905
Skarpeta dla szczurów	Sew Elegant (San Diego, Kalifornia)	N / A
Rura PVC 2 1/2 "	U.S. Plastic Co.	34108
Subminiaturowe piny i gniazda D	TE Connectivity	205089-1
Drut muzyczny ze stali nierdzewnej o średnicy 0,010 cala	Precision Brand Products, Inc.	21010
Stereotaktyczna rama mocująca	Kopf Instruments	Model 900
Stereotaktyczne nauszniki	Kopf Instruments	Model 957
Manipulator stereotaktyczny	Kopf Instruments	Model 960
1/2 mm wiertło	Henry Schein	100-3995
Wiertło dentystyczne Quiet-Air	Midwest Dental	393-1600
Śruba ze stali nierdzewnej 0-80 1/8 "	Łącznik superstore	247438
probówka wirówkowa 0,2 ml	Fisher Scientific	05-407-8A
Niestandardowa belka do trzymania głowicy	UCSD SIO Warsztat maszynowy	Nie dotyczy
Kątowy zacisk słupkowy	Newport	MCA-1
8-32 3/4" śruba	Łącznik Superstore	240181
śruba 4-40 1/4"	Łącznik Superstore	239958
Rurki kapilarne kwarcowe	Sutter Instruments	QF-100-60-10
Mikromanipulator z napędem	silnikowym Sutter Instruments	MP-285
Wzmacniacz mikroelektrod	Urządzenia molekularne	Multiclamp 700B	Część alternatywna: Urządzenia molekularne Axoclamp 900A
głowicy wzmacniacza mikroelektrodowego	Urządzenia molekularne	CV-7B	Część alternatywna: HS-9Ax10 z urządzeniami molekularnymi Axoclamp 900A
Izolowany stymulator impulsów	A-M Systems	Model 2100	Część alternatywna: HS-9Ax10 z urządzeniami molekularnymi Axoclamp 900A
Monitor audio	Radio Shack	32-2040
Przewód elektrodowy	Drut Cooner	NEF34-1646
Przekaźnik do stopnia głównego wzmacniacza	COTO Technology	#2342-05-000	(opcjonalnie) Używany z niestandardową płytką drukowaną (UCSD Physics Electronics Shop), Rysunek 6A-C
Cyfrowa kamera wideo	Basler	A602fm
Uchwyt na pipety	Warner Instruments	#MEW-F10T
Niestandardowa płyta mocująca głowę	UCSD SIO Warsztat Mechaniczny	N/A

Stopień