Obrazowanie bioluminescencyjne w celu oceny wzrostu guza w organotypowym wycinku mózgu myszy

Streszczenie

Źródło: Ciraku, L., et. al. Model wycinka mózgu ex vivo do badania i celowania we wzrost guza przerzutowego do mózgu raka piersi. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film pokazuje obrazowanie komórek nowotworowych wyrażających lucyferazy w organotypowym wycinku mózgu myszy. Lucyferyna jest dodawana do pożywki, a płytkę umieszcza się w komorze systemu obrazowania in vivo. Parametry przechwytywania obrazu są dostosowywane, a kształt i rozmiar guza są definiowane. Następnie rejestrowane są sygnały bioluminescencyjne emitowane przez komórki nowotworowe.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

Uwaga: W tym badaniu wykorzystano samice myszy atymimiczne Nu/Nu (w wieku 6-8 tygodni).

1. Wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie komórek nowotworowych

1. Wysterylizuj cały sprzęt (pęsetę, nożyczki, nożyczki do szycia, wiertarkę ręczną) w suchym cyklu autoklawu do 45 minut w woreczkach sterylizacyjnych, w tym ze wskaźnikiem sterylizacji. Jeśli operacje są przeprowadzane na wielu zwierzętach, sterylizuj narzędzia między zwierzętami za pomocą podgrzewanego sterylizatora kulkowego (do 3x).
2. Znieczulić myszy zgodnie z protokołem opieki nad zwierzętami (np. izofluran (4% do indukcji, 1-2% do konserwacji) i podać znieczulenie (podskórnie, 0,1 ml 0,1 mg/kg buprenorfiny SR-LAB) przed rozpoczęciem operacji. Zapewnij optymalną głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi.
3. Umieść myszy w ramie stereotaktycznej i unieruchom głowę za pomocą standardowych nauszników (Rysunek 1A). Następnie nałóż maść okulistyczną na oczy.
4. Wysterylizuj powierzchnię głowy poprzez wielokrotne, naprzemienne nakładanie (3x) wacików jodowych i 70% etanolu przed nacięciem.
5. Użyj skalpela chirurgicznego, aby wykonać 1-centymetrowe nacięcie w linii środkowej skóry pod lekko ukośnym kątem do wyimaginowanej linii, która dzieli mózg myszy na dwie symetryczne połowy, aby odsłonić czaszkę. Przetrzyj krew bawełnianym wacikiem.
6. Odchylić skórę na boki, aby odsłonić miejsce wstrzyknięcia: 2 mm po prawej stronie, 1 mm do przodu w odniesieniu do bregmy +2 przyśrodkowo-boczne (+2ML), +1 rostralne/ogonowe (+1RC).
7. Użyj wiertła (0,73 mm), aby wbić się w czaszkę +2ML, +1RC do bregmy i wywierć otwór, używając lekkiego nacisku i ruchu skręcającego.
8. Użyj strzykawki do wstrzykiwania mózgu, aby wstrzyknąć 5 μl 100 000 komórek MDA-MB-231BR (stabilnie eksprymujących zielone białko fluorescencyjne lub GFP-lucyferazę) / μL roztworu w sterylnym roztworze soli fizjologicznej z 1x buforem fosforanowym (PBS), początkowo wkładając strzykawkę na głębokość 3,5 mm do mózgu.
9. Pozostawić strzykawkę na 2 minuty, aby osiadała. Pociągnąć ją do góry na około 1 mm, a po 2 minutach powoli wstrzyknąć pierwszą połowę objętości.
10. Należy odczekać kolejne 2 minuty przed wstrzyknięciem pozostałej części, a następnie powoli wyciągnąć strzykawkę 3 minuty po ostatnim wstrzyknięciu. nuta: Powolne wstrzykiwanie jest empiryczne, ponieważ pozwala na dobre wchłonięcie objętości przez tkankę mózgową i nie powoduje wycieku po wyciągnięciu strzykawki, co może prowadzić do wzrostu komórek rakowych poza zamierzonym miejscem.
11. Nałóż wosk kostny na miejsce wstrzyknięcia na czaszce, a następnie użyj szwów polipropylenowych do zszycia tkanki. Myszy wyzdrowieją w ciągu 5 minut po usunięciu znieczulenia.
12. Monitoruj ich zachowanie zaraz po operacji przez około 10 minut, 3 godziny później i następnego dnia, aby ustalić, czy potrzebne jest specjalne leczenie, w tym wstrzyknięcie soli fizjologicznej, miękkiego jedzenia itp., Aby pomóc w szybkim powrocie do zdrowia.
13. Monitoruj wzrost guza za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego w systemie obrazowania.
    1. W tym celu, najpierw, włącz tlen i izofluran w systemie obrazowania. Pozwól, aby oba zostały rozprowadzone w oddzielnej komorze na zewnątrz pudełka do obrazowania.
    2. Następnie włącz oprogramowanie, zainicjuj instrument i wybierz odpowiednią opcję wizualizacji i uchwycenia całego korpusu myszy.
14. Umieść myszy w osobnej komorze z izofluranem i zapewnij optymalną głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca. Wstrzyknąć myszom dootrzewnowo 200 μl 30 mg/ml lucyferyny.
15. Przenieś żołądek myszy do nosa komory obrazowania zaopatrzonego w tlen i izofluran. Zablokuj komorę i wybierz 2-minutowy czas ekspozycji, aby rozpocząć obrazowanie.
16. Użyj narzędzia ROI (region zainteresowania) oprogramowania, aby określić ilościowo sygnał bioluminescencyjny guza.
17. Aby przeanalizować rozmiar guza, wybierz narzędzie w kształcie koła, aby dopasować go do kształtu i rozmiaru guza. Zmierz zwrot z inwestycji i podaj łączne odczyty.
18. Pozwól na wzrost guza litego przez 12-14 dni (lub do momentu, gdy lucyferazy osiągnie około 7,0 x 10⁶ jednostek) (Figura 1B) przed wygenerowaniem wycinków mózgu. nuta: Zwiększenie liczby komórek do wstrzyknięcia doprowadzi do szybszego wzrostu guza; W związku z tym generowanie wycinków mózgu może nastąpić wcześniej niż 12 dni. Z drugiej strony, większy guz doprowadzi do większej liczby plastrów GFP+, jeśli pozwoli się mu rosnąć przez 14 dni. Po 14 dniach zdrowie myszy zaczyna się szybko pogarszać; W związku z tym monitorowanie zdrowia zwierząt powinno zostać zwiększone do jednego dziennie po upływie 10-dniowego punktu czasowego, a wszelkie myszy wykazujące oznaki bólu i/lub dyskomfortu powinny być wykorzystywane do generowania plastrów.

2. Wygeneruj wycinki mózgu

UWAGA: Wykonaj kroki po izolacji mózgu w sterylnym okapie z przepływem laminarnym. Zazwyczaj możliwe jest wygenerowanie 35-40 pojedynczych wycinków zawierających komórki nowotworowe (sygnał lucyferazy) z jednej myszy, której wstrzyknięto komórki MDA-MB-231BR (Figura 1C).

1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie. Umieść krajalnicę do tkanek w sterylnym okapie z przepływem laminarnym i wyczyść wszystkie narzędzia i instrumenty 70% etanolem.
2. Po 12-14 dniach od wewnątrzczaszkowego wstrzyknięcia komórek MDA-MB-231BR należy znieczulić myszy zgodnie z protokołem opieki nad zwierzętami użytkownika, jak opisano w 1.2. Zapewnij optymalną głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi.
3. Usunąć i umieścić ich mózgi szybko (w ciągu 45 s) w lodowatym (4 °C) sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym lub sacharozie-ACSF składającym się z następujących składników: 280 mM sacharozy, 5 mM chlorku potasu (KCl), 2 mM chlorku magnezu (MgCl₂), 1 mM chlorku wapnia (CaCl₂), 20 mM glukozy, 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego lub HEPES, 5 mM (Na+)-askorbinianu sodu, 3 mM tiomocznik, 2 mM Na+, 29 mM pirogronian; pH=7,3.
4. Za pomocą ostrego, sterylnego skalpela lub żyletki odetnij nadmiar części mózgu, które nie zawierają guza ze wszystkich stron, w tym dolną część mózgu.
5. Doprowadź kształt mózgu do nieidealnego sześcianu, aby usiąść płasko na bibule filtracyjnej zwilżonej ACSF na pokrywie naczynia o średnicy 60 mm, aby ułatwić krojenie. nuta: Dodatkowa tkanka mózgu, w której guz prawdopodobnie nie wyrósł, jest usuwana przed krojeniem, aby umożliwić wytworzenie głównie plasterków GFP+ i stworzenie kształtu mózgu, który jest stabilny na powierzchni instrumentu i nie będzie zakłócony przez wibracje spowodowane krojeniem.
6. Umieść kilka arkuszy wstępnie zwilżonych (z ACSF) kółek z bibuły filtracyjnej na platformie tnącej i umieść na niej zablokowaną tkankę.
7. Ustaw rozmiar cięcia na instrumencie na 2 lub 2.5 jednostki na dołączonej linijce, aby pokroić tkankę na odcinki 200-250 μm. nuta: Dopuszczalne są plastry o grubości do 350 μm lub o grubości do 100 μm. W przypadku plastrów <200 μm użyj wibratomu lub kompresu.
8. Za pomocą pędzla (sobolowego) przenieś plastry mózgu do naczynia zawierającego sacharozę ACSF i oddziel plastry pod mikroskopem świetlnym za pomocą igieł o sile 27 G.
9. Zidentyfikuj plastry GFP-dodatnie pod mikroskopem fluorescencyjnym i przenieś je do nowego naczynia o średnicy 60 mm zawierającego 2-3 ml pożywki dla dorosłych plastrów (podłoże neuropodstawowe A, 2% suplement B12, 1% suplement N2, 1% glutamina, 0,5% glukozy, 10 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) za pomocą sterylnej 1 ml odłamanej pipety (szeroki otwór). nuta: Wycinki mózgu, które zawierają komórki nowotworowe rosnące na powierzchni mózgu (być może z powodu wycieku komórek iniekcyjnych itp.) są wykluczone.
10. Przenieś 3-5 plasterków na każdą 30 mm wkładkę do hodowli tkankowej o wielkości porów 0,4 μm na płytkach 6-dołkowych w odległości, która nie pozwala na wrastanie jedna w drugą.
11. Usuń nadmiar pożywki z powierzchni wkładki za pomocą pipety P1000, dodaj 1 ml pożywki do plastrów dla dorosłych myszy pod każdą wkładkę i wyrównaj pożywkę w inkubatorze przed krojeniem.
12. Inkubować tkanki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i wilgotności 95% przez 24 godziny przed obrazowaniem.

3. Obrazowanie plastrów metodą in vivo Imaging System (IVIS)

UWAGA: Wykonaj etapy dodawania lucyferazy i inhibitora w sterylnym okapie z przepływem laminarnym.

1. Odpipetować 5 μl roztworu lucyferyny o stężeniu 30 mg/ml do pożywki znajdującej się pod wkładkami, podnosząc wkładkę za kleszcze i umieszczając ją z powrotem w studzience po dodaniu lucyferyny do pożywki w studzience.
2. Umieść 6-dołkową płytkę z pokrywką w komorze obrazowania instrumentu poniżej kamery stacjonarnej i zablokuj drzwiczki komory.
3. Otwórz oprogramowanie i zainicjuj instrument.
4. Wybierz ustawienia kamery, które umożliwiają wizualizację i uchwycenie tylko jednego dołka na obraz. Przesuń stolik w górę (pole widzenia lub pole widzenia 5 cm) i umieść studnię, która ma być sfotografowana, bezpośrednio pod kamerą.
5. Ustaw czas obrazowania na najbardziej odpowiedni w zależności od intensywności lucyferazy, którą guz będzie emitował, który może wynosić od 10 s do 5 min. Zacznij od ustawienia go na 10 s, a następnie zwiększaj, jeśli sygnał jest niski, ale utrzymuj go na stałym poziomie dla wszystkich punktów czasowych i warunków do końca eksperymentu (ryc. 1D).
6. Użyj narzędzia ROI (narzędzie w kształcie koła), dopasuj je do kształtu i rozmiaru guza, zmierz ROI i podaj całkowite odczyty, aby określić ilościowo sygnał bioluminescencyjny każdego guza na plasterku.

Wyniki

Rysunek 1. Wstrzyknięcie wewnątrzczaszkowe, generowanie wycinków mózgu i wzrost BCBM ex vivo. (A) Schematyczne przedstawienie myszy podczas iniekcji wewnątrzczaszkowej pod instrumentem stereotaktycznym. (B) Reprezentatywne obrazy biolumines...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
strzykawka >1 ml, końcówka poślizgowa	BD	309659
30 igieł G1/2	BD	305106
płytki 6-dołkowe	Genessee	25-105
Mikroskop automatyczny i oprogramowanie LUMAVIEW	Etaluma	LS720
B27 (GEM21)	Gemini Bio-Products	400-160
Zlewka 50 ml	Fisher	10-210-685
Tępy pędzel sobolowy, rozmiar #5/0	Mikroskopia elektronowa Sciences	66100-50
Wosk kostny	ModoMed	DYNJBW25
Strzykawka	do wstrzykiwań mózguHamilton Company	80430
CaCl₂	Fisher Scientific	BP510-250
D-Lucyferin Sól potasowa	Perkin Elmer	122799
Żyletka z podwójną krawędzią	VWR	55411-060(95-0043)
Bibuła filtracyjna , koła ilościowe, 4.25 cm	Fisher	09-805a (1001-042)
Drobny pędzel sobolowy #2/0	Mikroskopia elektronowa Sciences	66100-20
Kleszcze	Fine Science Tools	11251-20
Glukoza	Sigma Aldrich	G8270
Glutamina (200 mM)	Corning cellgrow	25-005-CL
z mikro mini wiertłami krętymi	Amazon	YCQ2851920086082DJ
HEPES, wolny kwas	Fisher Scientific	BP299-1
Tylko dla myszy Stereotaktyczny aparat	ramowy Harvard (Holliston, MA, USA).	72-6049, 72-6044
KCl	Fisher Scientific	S271-10
Duże nożyczki chirurgiczne	Fine Science Tools	14001-18
Komórki MDA-MB-231BR	Uprzejmie dostarczone przez dr Patricię Steeg	Ref 14
MgCl₂·6H₂O	Fisher Scientific	M33-500
Urządzenie do obrazowania myszy		Perkin	Elmer IVIS 200
Oprogramowanie do obrazowania myszy	Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).		do żywego obrazu
Czytnik mikropłytek Tecan	Spark
Rozwiązanie montażowe	Odczynnik Invitrogen	P36935
MTS	Promega CellTiter 96 Roztwór wodny	(Cat: G3582)
Suplement N2	Life Technologies	17502-048
Neuropodstawowy średni	Życie Technologie	21103049
myszy atymiczne Nu/Nu	Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)
Paraformaldehyd	Affymetrix	19943
Pen/Strep	Life Technologies	145140-122
Szew polipropylenowy	Dostawa Medex	ETH-8556H
Wacik z jodu powidonu kije	DME Supply USA	Nr kat.: 689286X
Ostrze skalpela #11 (opakowanie 100)	Fine Science Tools	10011-00
Rękojeść skalpela #3	Fine Science Tools	10003-12
Pirogronian sodu	Sigma Aldrich	S8636
Szpatułka/sonda	Fine Science Tools	10090-13
SS Niepowlekane żyletki z podwójną krawędzią (amerykańska maszynka do golenia co (95-0043))	VWR	55411-060
Sacharoza	Amresco	57-50-1
Skalpel chirurgiczny	Exelint International	D29702
Rozdrabniacz do tkanek	Brinkman	(typ McIlwaina)
Wkładki do hodowli tkanek	Millipore	PICMORG50 lub PICM03050

Zestaw wiertarek ręcznych System Oprogramowanie