Stereotaktyczne mikrowstrzyknięcie wektora wirusowego do manipulacji genami u prążkowia szczeniąt myszy

Streszczenie

Źródło: Chen, S., et al., Stereotaktyka chirurgiczna w komórkach prążkowia noworodków w mózgach myszy noworodków. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego kodującego rekombinazę Cre i białko zielonej fluorescencji lub GFP do prążkowia genetycznie zmodyfikowanego szczeniaka myszy w celu uzyskania manipulacji genami poprzez wycięcie kasety STOP po bokach loxP, aktywując białko czerwonej fluorescencji lub RFP jako reportera.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Mikroiniekcja

1. Przygotuj sterylną operację, dokładnie wycierając instrument stereotaktyczny 70% etanolem. Zanurz narzędzie chirurgiczne w 70% etanolu, aby je wysterylizować.
2. Wyszoruj głowę szczeniaka 70% etanolem. Zlokalizuj punkt orientacyjny lambda na czaszce i zaznacz lambdę markerem. Skieruj końcówkę igły na lambdę i ustaw współrzędne przednio-tylne (AP) i przyśrodkowo-boczne (ML) na zero.
3. Przesunąć ramię iniekcyjne do miejsca docelowego zgodnie ze współrzędnymi X i Y miejsca docelowego. Dla prążkowia dnia pourodzeniowego (P) 2 młode współrzędne to: AP, +2,4 mm przed lambdą; ML, ±1,0 mm bocznie od linii środkowej; grzbietowo-brzuszna (DV), −1,7 mm od czaszki. Zaznacz długopisem położenie szybkiego zielonego barwnika w probówce PE10.
4. Powoli opuść igłę do wstrzykiwań 30G, aby przeniknęła przez skórę i czaszkę, a następnie podnieś końcówkę igły, aż zatrzyma się na powierzchni czaszki. Ustaw współrzędną DV na zero.
5. Powoli opuść igłę do wstrzykiwań 30G, aż osiągnie współrzędną DV miejsca docelowego. Odczekaj 1 minutę, aby miąższ powrócił do normalnego kształtu. Następnie uruchomić program mikroiniekcji (100 nL/min).
6. Upewnij się, że ślad szybkiego zielonego barwnika porusza się w probówce PE, aby upewnić się, że płyn wirusowy został wstrzyknięty do mózgu.
7. Odczekać 1 minutę po zakończeniu mikroiniekcji, a następnie powoli i stopniowo podnosić igłę do 1/2 wysokości DV w ciągu 30 sekund. Po 30 s powoli wyjmij igłę z głowy szczeniaka.

2. Rekonwalescencja pooperacyjna szczeniaka

1. Rozgrzej szczenię przez 20 minut w inkubatorze o temperaturze 33 °C. Sprawdzaj powrót szczeniaka do zdrowia po znieczuleniu hipotermicznym co 5 minut, aż szczenię odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać leżący mostek.
2. Zwróć szczenię do tamy po tym, jak szczenię w pełni wyzdrowieje.

Materiały