Artykuł metodologiczny

Eksperymentalna manipulacja rozmiarem ciała w celu oszacowania morfologicznych zależności skalowania u Drosophila

16.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3162

⸱

1 października 2011

 ,  ,  , 
1Department of Biology & Biochemistry, University of Houston, 2Department of Zoology, Michigan State University

W tym artykule

Podsumowanie

Morfologiczne zależności skalowania pozwalają uchwycić i opisać kształt organizmów. Przedstawiamy metodę pomiaru morfologicznych zależności skalowania w naturalnym zakresie wielkości ciała u owadów przechodzących pełny przeobrażenie. Dzięki prostej manipulacji dietą zwiększamy rozkład wielkości cech, co pozwala na dokładny opis współzmienności kształtu i wielkości.

Streszczenie

Skalowanie części ciała jest centralną cechą morfologii zwierząt1-7. W obrębie gatunku cechy morfologiczne muszą być odpowiednio proporcjonalne do ciała, aby organizm mógł prawidłowo funkcjonować; osobniki większe zazwyczaj mają większe części ciała, a osobniki mniejsze zazwyczaj mają mniejsze części ciała, tak aby ogólny kształt ciała był zachowany w całym zakresie rozmiarów ciał osobników dorosłych. Wymóg zachowania prawidłowych proporcji sprawia, że osobniki w obrębie gatunku wykazują zazwyczaj niewielką zmienność w relatywnej wielkości cech. Z kolei relatywna wielkość cech może się drastycznie różnić między gatunkami i stanowi główny mechanizm, dzięki któremu powstaje różnorodność morfologiczna. Ponad stulecie badań komparatywnych pozwoliło ustalić te wzorce wewnątrz- i międzygatunkowe3,4.

Być może najszerzej stosowanym podejściem do opisu tej zmienności jest obliczanie zależności skalowania między rozmiarem dwóch cech morfologicznych przy użyciu równania allometrycznego y=bxα, gdzie x i y oznaczają rozmiary dwóch cech, takich jak rozmiar narządu i rozmiar ciała8,9. Równanie to opisuje wewnątrzgrupową (np. gatunkową, populacyjną) zależność skalowania między dwiema cechami w miarę zmiany ich rozmiarów. Logarytmiczna transformacja tego równania prowadzi do prostego równania liniowego log(y) = log(b) + αlog(x), a wykresy log-log rozmiarów różnych cech u osobników tego samego gatunku zazwyczaj wykazują liniowe skalowanie z punktem przecięcia log(b) i nachyleniem α, zwanym „współczynnikiem allometrycznym”9,10. Zmienność morfologiczną między grupami opisuje się poprzez różnice w punktach przecięcia lub nachyleniu zależności skalowania dla danej pary cech. W konsekwencji zmienność parametrów równania allometrycznego (b i α) w sposób elegancki opisuje zmienność kształtu uchwyconą w relacji między rozmiarem narządu a rozmiarem ciała w obrębie i pomiędzy grupami biologicznymi (patrz 11,12).

Nie wszystkie cechy skalują się liniowo względem siebie lub względem rozmiaru ciała (np. 13,14). Z tego powodu morfologiczne relacje skalowania są najbardziej informacyjne, gdy dane obejmują pełny zakres rozmiarów danej cechy. W niniejszej pracy opisujemy, w jaki sposób prosta eksperymentalna manipulacja dietą może zostać wykorzystana do uzyskania pełnego zakresu rozmiarów ciała u owadów. Pozwala to na oszacowanie pełnej relacji skalowania dla dowolnej pary cech, co umożliwia kompletny opis współzmienności kształtu i rozmiaru oraz rzetelne porównanie parametrów relacji skalowania pomiędzy grupami biologicznymi. Choć skupiamy się na Drosophila, nasza metodologia powinna być możliwa do zastosowania niemal u każdego owada przechodzącego pełną metamorfozę.

Protokół

1. Hodowla i manipulacja dietą w celu uzyskania zmienności wielkości ciała i wielkości skrzydeł

Uzasadnienie i Przegląd. Ekspresja zależności skalowania zależy ostatecznie od rozwojowych procesów regulacyjnych, które generują zmienność końcowej wielkości organów i ciała. Procesy te są najlepiej opisane w pracach nad owadami przechodzącymi pełną przeobraźkę (tzn. holometabolnymi), takimi jak D. melanogaster, w których organy rozwijają się jako niezróżnicowane „dyski imaginalne” wewnątrz larwy przypominającej gąsienicę11,15-17. U Drosophila końcowa wielkość organów i ciała jest regulowana przez wzrost podczas stadiów larwalnych; larwy rosną przez pierwsze i drugie stadium larwalne, aż osiągną minimalną masę niezbędną do wylochania (MVWE) pod koniec trzeciego stadium larwalnego18. Głodzenie przed osiągnięciem MVWE uniemożliwia wylochanie osobników dorosłych. Jednak larwy głodzone przy osiągnięciu MVWE dają żywotne osobniki dorosłe, choć o bardzo małych rozmiarach. Dzieje się tak dlatego, że ograniczone odżywienie podczas rozwoju zmniejsza końcową wielkość ciała i organów, nie tylko u muszek, ale u niemal wszystkich zwierząt19-21. Poprzez manipulację dostępnością pokarmu po osiągnięciu MVWE, lecz przed zapoczątkowaniem przepoczwarzenia, możliwe jest wywołanie ekstremalnej plastyczności fenotypowej wielkości ciała, która znacznie przewyższa inne źródła zmienności (np. indywidualną zmienność genetyczną).

  1. Jaja są zbierane z populacji przeznaczonej do fenotypowania, dzielone na partie po 50 sztuk i umieszczane w fiolkach zawierających 10ml standardowej pożywki dla much. Ponieważ składanie jaj odbywa się w sposób ciągły, są one zbierane co 24h przez trzy dni, co pozwala na utworzenie trzech kohort wiekowych.
  2. W momencie, gdy najstarsza kohorta osiągnie stadium wędrowania lub właśnie zacznie przepoczwarzać się, stosuje się manipulację dietą. Na tym etapie najstarsza kohorta znajduje się znacznie powyżej MVWE, najmłodsza kohorta jest bardzo blisko MVWE, a pozostała kohorta znajduje się pomiędzy tymi ekstremami. Zatem usunięcie pożywki w tym momencie spowoduje uzyskanie bardzo dużych osobników dorosłych z najstarszej kohorty, bardzo małych z najmłodszej oraz osobników o średniej wielkości z pozostałej kohorty. Aby usunąć larwy z fiolek, do wszystkich naczyń dodaje się około 5ml 40% roztworu sacharozy. W celu uwolnienia larw, pożywkę miesza się przez 15-20 minut na stołach wstrząsowych ustawionych na średnią prędkość.
  3. Pływające larwy są usuwane z roztworu sacharozy za pomocą cienkiego (00) pędzla, przenoszone do fiolek z wilgotnym czopem watowym i pozostawiane do przepoczwarczenia. Alternatywnie larwy można umieścić na nietrawionym dodatku do pożywki, takim jak metyloceluloza22.

2. Pomiar wielkości ciała

Uzasadnienie i przegląd. Poprzednie badania wskazują, że długość klatki piersiowej nie jest idealnym wskaźnikiem całkowitej wielkości ciała22. Zamiast tego, jako miarę wielkości ciała wykorzystujemy rozmiar poczwarki. Maksymalna wielkość ciała zostaje ustalona w momencie zaprzestania żerowania poprzedzającego przepoczwarczenie. W rezultacie istnieje ścisła korelacja między rozmiarem poczwarki a wielkością ciała osobnika dorosłego23.

  1. Pokrywy są układane stroną brzuchową do góry na szklanych lamelkach i obrazowane za pomocą kamery cyfrowej przymocowanej do mikroskopu stereoskopowego. Każdy obraz jest rejestrowany, przypisany do unikalnego kodu identyfikacyjnego i przesyłany do komputera poprzez transmisję na żywo łączącą kamerę cyfrową z komputerem.
  2. Obrazowane pokrywy przenosi się do poszczególnych probówek typu epitube o pojemności 2 ml zawierających 1 ml pożywki dla much, etykietuje unikalnym kodem przypisanym do danej osobnika i nakłuwa otworami powietrznymi, aby umożliwić wymianę gazową.
  3. Wielkość pokrywy szacuje się jako liczbę pikseli sylwetki pokrywy. Można również zastosować inne wskaźniki wielkości.

3. Szacowanie wielkości cechy (skrzydła)

Uzasadnienie i przegląd. Do obrazowania skrzydeł używamy tzw. „chwytaka do skrzydeł”24, który wyciąga i utrzymuje skrzydło żywej, znieczulonej muchy prostopadle do jej ciała. Dzięki przyciśnięciu między dwiema szybkami skrzydło może być obrazowane jako obiekt dwuwymiarowy.

  1. Muchy są lekko znieczulone CO2 i umieszczane w uchwycie do skrzydeł pod mikroskopem sekcyjnym wyposażonym w kamerę cyfrową podłączoną do komputera.
  2. Wykonuje się obraz skrzydła i zapisuje go pod unikalnym kodem przypisanym do danej osobnicy.
  3. Wielkość skrzydła można oszacować, wykorzystując minimalny wielokąt wypukły obejmujący marginalne punkty orientacyjne lub obliczając liczbę pikseli sylwetki skrzydła.

4. Szacowanie zależności skalowania

  1. Dane z różnych kohort są łączone, ale rozdzielane według płci i poddawane transformacji logarytmicznej.
  2. Relacje skalowania są dopasowywane do danych o rozmiarze przy użyciu regresji typu II (tj. zredukowanej osi głównej – Reduced Major Axis) (patrz przegląd w 12), a parametry są szacowane dla każdej grupy.

5. Reprezentatywne wyniki:

Nasza manipulacja dietą spowoduje powstanie szerokiego zakresu wielkości ciała (Rysunek 1) oraz wielkości cech (Rysunek 2). Wykreślenie logarytmowanych cech względem siebie ujawnia wzorzec ich współzmienności w ramach danej grupy biologicznej i pozwala na dopasowanie relacji skalowania do tej grupy (Rysunek 3). Wyznaczenie parametrów relacji skalowania, które opisują, w jaki sposób kształt skaluje się wraz z wielkością ciała, umożliwia porównanie współzmienności kształtu i rozmiaru pomiędzy grupami.

Analiza morfologii owadów; obrazowanie wysokokontrastowe formy larwalnej; wykres badania porównawczego.
Rysunek 1. Poczwarki z ekstremów rozkładu wielkości, uzyskane poprzez manipulację dietą po osiągnięciu przez osobniki MVWE. Po lewej stronie przedstawiono rzeczywiste obrazy poczwarek, a po prawej odpowiadające im sylwetki służące do pomiaru wielkości poczwarki. Pasek skali wynosi 1mm.

Schemat morfologii skrzydeł owadów, wyróżniający wzory żyłkowania i porównawczą analizę kształtu.
Rycina 2. Skrzydła pobrane z ekstremów rozkładu wielkości ciała uzyskanego poprzez manipulację dietą po osiągnięciu przez osobniki MVWE. Po lewej stronie przedstawiono rzeczywiste zdjęcia skrzydeł, a po prawej odpowiadające im sylwetki służące do pomiaru wielkości skrzydeł. Pasek skali wynosi 1mm.

Wykresy rozrzutu powierzchni skrzydeł w stosunku do powierzchni poczwarki dla samców i samic; analiza danych, wyniki badań biologicznych.
Rysunek 3. Skalowanie wielkości skrzydeł względem ciała u Drosophila melanogaster w zależności od płci. Logarytmowane dane dla osobników każdej płci, które w stadium larwy były w pełni karmione (ciemne kółka), głodzone przez jeden dzień (szare kółka) lub dwa dni (puste kółka). Dla każdej płci przedstawiono linię regresji typu II. Między poszczególnymi kohortami wiekowymi występuje spadek średniej powierzchni skrzydeł o ok. 0,1 mm (~7%) i ok. 0,2 mm (~8%), co zwiększa całkowity zakres obserwowanych fenotypów. Regresje wykazują, że samice wykazują lekką hypoallometrię w tej relacji skalowania (nachylenie 0,96), podczas gdy samce wykazują lekką hyperallometrię (nachylenie 1,06).

Dyskusja

Skalowanie morfologiczne jest przedmiotem intensywnych badań w biologii ewolucyjnej od niemal wieku. W ostatnim czasie bezpośrednie podstawy regulacji wzrostu i skalowania stały się coraz ważniejsze w rozwoju, fizjologii i genetyce (np. patrz przeglądy w 12,15,23-25). Nasza metodologia umożliwia szacowanie relacji skalowania morfologicznego w całym zakresie wielkości cech i rozmiarów ciała. Może to mieć istotne znaczenie, ponieważ wielkość cechy może nie skalować się liniowo wraz z rozmiarem ciała (np. 13,14). Może to jednak nie być widoczne, jeśli zwierzęta są hodowane wyłącznie w idealnych warunkach laboratoryjnych.

Choć nasz protokół opracowano w celu umożliwienia oszacowania relacji skalowania między rozmiarem skrzydeł a rozmiarem ciała u Drosophila, może on zostać zastosowany – po wprowadzeniu modyfikacji specyficznych dla danej cechy – do oszacowania relacji skalowania dla dowolnej cechy morfologicznej u much. Podobnie, manipulacja dietą może prawdopodobnie służyć do uzyskania pełnego zakresu rozmiarów cech i ciała u innych owadów o pełnej przeobrażeniu; takie zastosowania wymagają jedynie określenia momentu osiągnięcia MVWE i zastosowania manipulacji w tym konkretnym punkcie ontogenezy.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Badania opisane w niniejszej pracy były finansowane z grantu National Science Foundation (DEB-0805818) przyznanego W.A.F., A.W.S. oraz I.D. Badanie to było również wspierane przez granty IOS-0845847 dla A.W.S., IOS-0919855 dla A.W.S. i I.D. oraz IOS-0920720 dla W.A.F.

Bibliografia

  1. Schmidt-Nielsen, K. Scaling: Why is animal size so important. , Cambridge University Press. (1984).
  2. Calder, W. A. Size, function and life history. , Harvard University Press. (1984).
  3. Huxley, J. S. Problems of relative growth. , Methuen & Co. (1932).
  4. Gould, S. J. Allometry and size in ontogeny and phylogeny. Biol. Rev. 41, 587-640 (1966).
  5. Alberch, P., Gould, S. J., Oster, G. F., Wake, D. B. Size and shape in ontogeny and phylogeny. Paleobiology. 5, 296-317 (1979).
  6. Thompson, D. W. On growth and form. , Cambridge University Press. (1917).
  7. Klingenberg, C. P. Heterochrony and allometry: The analysis of evolutionary change in ontogeny. Biol. Rev. 73, 79-123 (1998).
  8. Dubois, E. Sur le rapport de l'encéphale avec la grandeur du corps chez les Mammiferes. Bull. Soc. Anthropol. 8, 337-374 Forthcoming.
  9. Huxley, J. S., Teissier, G. Terminology of relative growth. Nature. 137, 780-781 (1936).
  10. Huxley, J. S. Constant differential growth-ratios and their significance. Nature. 114, 895-896 (1924).
  11. Shingleton, A. W., Frankino, W. A., Flatt, T., Nijhout, H. F., Emlen, D. J. Size and shape: The developmental regulation of static allometry in insects. BioEssays. 29, 536-548 (2007).
  12. Frankino, W. A., Emlen, D., Shingleton, A. W. Experimental approaches to studying the evolution of morphological allometries: The shape of things to come. Experimental evolution: Concepts, methods, and applications. Garland, T., Rose, M. , University of California Press. (2009).
  13. Emlen, D. J. Artificial selection on horn length-body size allometry in the horned beetle Onthophagus acuminatus. Evolution. 50, (1996).
  14. Emlen, D. J., Nijhout, H. F. The development and evolution of exaggerated morphologies in insects. Annu. Rev. Entomol. 45, 661-708 (2000).
  15. Shingleton, A. W. Body-size regulation: Combining genetics and physiology. Curr. Biol. 15, 825-827 (2005).
  16. Nijhout, H. F., Davidowitz, G., Roff, D. A. A quantitative analysis of the mechanism that controls body size in Manduca sexta. J. Biol. 5, 16.11-16.15 (2006).
  17. Davidowitz, G., Nijhout, H. F. The physiological basis of reaction norms: The interaction among growth rate, the duration of growth and body size. Integr. Comp. Biol. 44, 443-449 (2004).
  18. Stieper, B. C., Kupershtok, M., Driscoll, M. V., Shingleton, A. W. Imaginal discs regulate developmental timing in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 321, 18-26 (2008).
  19. Colombani, J. A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth. Cell. 114, 739-749 (2003).
  20. Mirth, C. K., Riddiford, L. M. Size assessment and growth control: How adult size is determined in insects. BioEssays. 29, 344-355 (2007).
  21. Thissen, J. P., Ketelslegers, J. M., Underwood, L. E. Nutritional regulation of the insulin-like growth factors. Endocr. Rev. 15, 80-101 (1994).
  22. Boots, M., Begon, M. Resource limitation and the lethal and sublethal effects of a viral pathogen in the Indian meal moth, Plodia interpunctella. Ecol. Entomol. 19, 319-326 (1994).
  23. Shingleton, A. W., Mirth, C. K., Bates, P. W. Developmental model of static allometry in holometabolous insects. Proc. R. Soc. B. 275, 1875-1885 (2008).
  24. Stern, D. L., Emlen, D. J. The developmental basis of allometry in insects. Development. 126, 1091-1101 (1999).
  25. Emlen, D. J., Allen, C. E. Genotype to phenotype: Physiological control of trait size and scaling in insects. Integr. Comp. Biol. 43, 617-634 (2003).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wielko cia a Drosophilar wnanie allometrycznemanipulacja dietpomiar wielko ci skrzydeanaliza sylwetki poczwarkiregresja typu drugiegokohorty larwalneroztw r sacharozyobrazowanie mikroskopowe

Powiązane artykuły