Implantacja okienka rdzenia kręgowego u myszy do obrazowania in vivo

Streszczenie

Źródło: Pietruczyk, E. A., et al. Laminektomia i implantacja okienka rdzenia kręgowego u myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film pokazuje wszczepienie okienka rdzenia kręgowego znieczulonej myszy do obrazowania in vivo. Protokół stabilizuje odsłonięty rdzeń kręgowy za pomocą borokrzemianowego szkła osłonowego i wydrukowanej w 3D płyty tylnej. Metoda ta umożliwia mikroskopię dwufotonową o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania dynamiki bariery krew-mózg i interakcji nerwowo-naczyniowych.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Implantacja szkła nakrywkowego

1. Delikatnie nałóż borokrzemianowe szkło nakrywkowe o grubości 3 mm na odsłonięty sznurek.
2. Upewnij się, że agaroza jest schłodzona do 39 °C. Za pomocą małej szpatułki nałóż ciepłe 2% agarozy/aCSF (sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy) na krawędź szkła nakrywkowego i pozwól, aby działanie kapilarne wciągnęło go pod powierzchnię.
   Uwaga: W temperaturach poniżej 39 °C agaroza może zacząć żelować. W takim przypadku podgrzej je w łaźni wodnej lub kuchence mikrofalowej. Niektórzy operatorzy wolą najpierw nałożyć jedną kroplę agarozy i położyć na niej szkło nakrywkowe.
3. Nałożyć klej tkankowy na odsłonięte kostne wyrostki stawowe nienaruszonych sąsiednich kręgów na poziomie klatki piersiowej 11 kręgosłupa kręgowego i kręgosłupa piersiowego 13. Nałóż dodatkowy klej tkankowy w pierścieniu wokół miejsca laminektomii, na sąsiednie ścięgno i wyrostek poprzeczny.
   Uwaga: Klej tkankowy jest wymagany do prawidłowego przylegania do cementu dentystycznego w kolejnych krokach. Wyrostki stawowe tworzą naturalne siedzenie, na którym płyta tylna może stabilnie spoczywać (ryc. 1). Przyleganie do wyrostków stawowych będzie stanowić najmocniejsze punkty przywiązania.
4. Wymieszaj cement dentystyczny z przyspieszaczem w porcelanowej tacy. Użyj małej szpatułki, aby przenieść cement dentystyczny na warstwę kleju tkankowego. Użyj cementu dentystycznego, aby przykleić tylną płytę do pola operacyjnego wyśrodkowanego nad oknem. Odczekaj 10 minut, aż cement dentystyczny się utwardzi .
   Uwaga: Mocne przyleganie tylnej płytki do przednich i tylnych wyrostków stawowych zapewnia podstawową stabilność strukturalną implantu.
5. Użyj dodatkowego cementu dentystycznego, aby wypełnić wewnętrzną podstawę płyty tylnej i spód płyty tylnej: interfejs tkankowy.
   Uwaga: Dodatkowe zastosowanie cementu dentystycznego poprawia przyczepność i zmniejsza ryzyko wycieku płynu zanurzeniowego do obiektywów mikroskopowych (soli fizjologicznej) z dna płyty tylnej.
6. Przesuń rozwidlony uchwyt płyty tylnej do odpowiedniej pozycji nad oknem. Przymocuj tylną płytę do uchwytu płyty tylnej za pomocą.
   Uwaga: W tym protokole wykorzystano specjalnie obrobiony uchwyt płyty tylnej (Rysunek 2G\u2012H).
7. Nałóż sól fizjologiczną na tylną płytę, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków. Jeśli dojdzie do wycieku płynu, osusz obszar i nałóż więcej cementu dentystycznego.

2. Przygotowanie do obrazowania

1. Przenieś zwierzę na platformę chirurgiczną na stół optyczny.
   Uwaga: Nasza platforma chirurgiczna, uchwyt płyty tylnej i uchwyt stożka nosowego izofluranu mogą być transportowane między stacjami obrazowania chirurgicznego i dwufotonowego jako jedna jednostka podczas stosowania ciągłego znieczulenia izofluranem (ryc. 2D, H). Podobne jednostki można montować z wideł mocujących, belek i słupków wsporczych, które można uzyskać ze źródeł komercyjnych (np. ThorLabs). W przypadku mikroskopii przyżyciowej powinien być co najmniej 11 cali odstępu między obiektywem mikroskopu a stołem optycznym, aby dostosować się do wysokości platformy operacyjnej.
2. Przymocuj platformę chirurgiczną do stołu optycznego za pomocą słupka montażowego ze stali nierdzewnej i pogłębionego widelca zaciskowego.
3. Nałóż świeżą sól fizjologiczną do studzienki płyty tylnej. Opuść soczewkę zanurzeniową w wodzie do studni.
4. Użyj światła przechodzącego lub epifluorescencyjnego, aby zidentyfikować obszar zainteresowania i ostrości. Przełącz się w tryb skanowania laserowego i wykonaj obrazowanie in vivo zgodnie z odpowiednimi filtrami dwufotonowego odcinka fali wzbudzenia laserowego, dichroicznymi i pasmowoprzepustowymi dla fluoroforów obecnych w tkance6.

Wyniki

Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie anatomicznego rozmieszczenia okna rdzenia kręgowego. A) Schematyczne przedstawienie widoku z góry dolnego trzonu kręgu piersiowego, wyrostka kolczystego i segmentu rdzenia kręgowego (sc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Niestandardowa		owalna płyta tylna wydrukowana w 3D	Stabilizujące pole obrazowania
Chirurgiczny mikroskop preparacyjny	Leica	M205 C	Wyposażony w Leica FusionOptics, obiektyw Planapo 0,63x serii M i stolik
ślizgowyKamera mikroskopowa	Kolorowa kamera Leica	MC170	HD do wizualizacji pola operacyjnego
Stopień ślizgowy	Leica	10446301	Stopień ślizgowy zbudowany jest z dwóch metalowych płytek. Płyta podstawy jest zamocowana. Górna płyta przesuwa się po nasmarowanym interfejsie, aby umożliwić ruch obrotowy i liniowy.
Stacja chirurgiczna i widelec stabilizacyjny	Produkcja wielorybów	niestandardowa	laminektomia
Jednostka dostarczająca izofluran o niskim przepływie SomnoSuite	Kent Scientific	SS-01	Podawanie znieczulenia chirurgicznego ze zintegrowanym waporyzatorem cyfrowym
Słupek montażowy ze stali nierdzewnej 1,5 cala	ThorLabs	P50/M	Do montażu stanowiska chirurgicznego na stole optycznym w celu obrazowania
dwufotonowegoWidelec zaciskowy z pogłębieniem do montażu 1,5" Słupek	ThorLabs	PF175	Do stabilizacji stanowiska chirurgicznego Montaż na stole optycznym do obrazowania dwufotonowego
Idealne mikrowiertło do kości	Aparat Harvard	72-6065	Przerzedzenie kości do laminektomii
Kąpiel wodna	Fisher Scientific	15-462-10	Sól fizjologiczna rozgrzewająca
Pistolet do kauteryzacji	FST	18010-00	Kauteryzacja drobnych krwawień
Poduszka grzewcza	Benchmark	BF11222	silikonowa grzałka 1,9" x 4,5" z 20-calowymi przewodami teflonowymi, 10W, 5V
Sonda doodbytnicza z termosprzężonym typem K	Physitemp	RET3	Pomiar temperatury ciała myszy
Wazelina	Sigma	8009-03-08	Smarująca sonda doodbytnicza
Regulator termiczny regulowany sprzężeniem zwrotnym	niestandardowy	NA	Dostępne na rynku alternatywy obejmują serię Physitemp TCAT
PVA Chirurgiczne włócznie do oczu	Beaver-visitec international	40400-8	Wchłanianie krwi
Trymer elektryczny	Wahl	41590-0438	Przycinanie futra myszy
Ostrze, #11	FST	14002-14	Kleszcze do narzędzi chirurgicznych
, #5	FST	11254-20	Kleszcze do narzędzi chirurgicznych
, #4	FST	14002-14	Narzędzie chirurgiczne
Kleszcze zębate Titatnium	WPI	555047FT	Narzędzie chirurgiczne
Nożyczki do tytanu	Irys WPI	555562S	Narzędzie chirurgiczne
Klej tkankowy Vetbond	3M	084-1469SB	Przygotowanie powierzchni tkanki pod akryl dentystyczny
Ceramiczna taca do mieszania	Jack Richeson	420716	Mieszanie dentystycznego środka akrylowego z akceleratorem
Akryl dentystyczny Orthojet	Lang Dental	1520BLK, 1503BLK	Trwale wiążąca tylna płytka z tkanką
Małe okrągłe szkło nakrywkowe, grubość #1, 3 mm	Aparat Harvard	64-0720	Okno optyczne
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5	Dla aCSF
KCl	Fisher Scientific	7447-40-7	Dla glukozy aCSF
	Fisher Scientific	50-99-7	Dla aCSF
HEPES	Sigma	7365-45-9	Dla aCSF
MgCl₂·6H₂O	Fisher Scientific	7791-18-6	Dla aCSF
CaCl₂·2H₂O	Fisher Scientific	#################	Dla aCSF
Carprofen	Rimadyl	QM01AE91	Analgezja
Woda bakteriostatyczna	Henry Schein	2587428	Rozcieńczalnik do karprofenu
Izofluran	Henry Schein	11695-6776-2	Znieczulenie
Mleczanowy roztwór dzwonka	Baxter	0338-0117-04	Hydration dla myszy
Agaroza High EEO	Sigma	A9793	żel punktowy 34-37 stopni C
Okulistyczna maść nawilżająca	Akwa Tears	68788-0697	Zapobiegaj wysuszeniu rogówki
Mikroskop dwufotonowy MOM	Sutter