Wizualizacja wirusa dengi za pomocą znakowania Alexa Fluor

Podsumowanie

Wykorzystując postępy w opracowywaniu fluoroforów oraz technologii obrazowania, opracowano prostą metodę znakowania wirusa dengi barwnikami Alexa Fluor w celu wizualizacji wczesnych oddziaływań między wirusem a komórką.

Streszczenie

Wczesne zdarzenia w interakcji między wirusem a komórką mogą mieć głęboki wpływ na wynik infekcji. Określenie czynników wpływających na tę interakcję mogłoby prowadzić do lepszego zrozumienia patogenezy choroby, a tym samym wpłynąć na projektowanie szczepionek lub terapii. W związku z tym użyteczne byłoby opracowanie metod pozwalających badać tę interakcję. Niedawne postępy w rozwoju fluoroforów^1-3 oraz technologii obrazowania⁴ mogą zostać wykorzystane do poszerzenia naszej obecnej wiedzy na temat patogenezy dengi, co utoruje drogę do ograniczenia milionów infekcji tym wirusem występujących corocznie.

Otoczka wirusa dengi składa się z zewnętrznego rusztowania utworzonego przez 90 dimerów glikoproteiny otoczki (E), które chronią skorupę nukleokapsydu zawierającą pojedynczą dodatnią nić RNA genomu⁵. Identyczne podjednostki białkowe na powierzchni wirusa mogą zatem zostać oznakowane barwnikiem reaktywnym wobec grup aminowych i zwizualizowane za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Przedstawiamy tutaj prostą metodę znakowania wirusa dengi barwnikiem Alexa Fluor z estrem succinimidylowym, rozpuszczonym bezpośrednio w buforze wodorowęglanowym sodu, która pozwoliła na uzyskanie wysoce żywotnych wirusów po znakowaniu. Nie istnieje ustandaryzowana procedura znakowania żywych wirusów, a istniejące protokoły producentów dotyczące znakowania białek zazwyczaj wymagają rozpuszczenia barwnika w dimetylosulfoksydzie. Obecność dimetylosulfoksydy, nawet w śladowych ilościach, może blokować produktywną infekcję wirusem oraz indukować cytotoksyczność komórkową⁶. Wykluczenie zastosowania dimetylosulfoksydy w niniejszym protokole zredukowało zatem tę możliwość. Barwniki Alexa Fluor charakteryzują się doskonałą fotostabilnością i są mniej wrażliwe na pH niż powszechnie stosowane barwniki, takie jak fluoresceina i rodamina², co czyni je idealnymi do badań nad pobieraniem komórkowym i transportem endosomalnym wirusa. Koniugacja z barwnikiem Alexa Fluor nie wpłynęła na rozpoznawanie znakowanego wirusa dengi przez specyficzne przeciwciała przeciwwirusowe oraz jego domniemane receptory w komórkach gospodarza⁷. Metoda ta może znaleźć przydatne zastosowania w badaniach wirologicznych.

Protokół

1. Znakowanie wirusa dengi barwnikami Alexa Fluor

1. Przed reakcją znakowania należy oczyścić wirusa dengue za pomocą poduszki sacharozowej oraz przygotować niezbędne odczynniki i sprzęt zgodnie z opisem w protokole.
2. Bezpośrednio przed znakowaniem należy przygotować świeży bufor wodorowęglanowy 0,2M o pH 8,5 (bufor do znakowania) oraz bufor hydroksyloaminowy 1,5M o pH 8,3 (odczynnik zatrzymujący), a następnie poddać je sterylizacji przez filtrowanie za pomocą filtrów strzykawkowych 0,2μm.
3. W probówce o pojemności 2ml należy rozcieńczyć około 3x10⁸ jednostek tworzących plak (pfu) oczyszczonego wirusa dengue w 1ml buforu do znakowania. W przypadku znakowania wirusa w większych partiach można proporcjonalnie zwiększyć skalę procesu.
4. Bezpośrednio przed reakcją znakowania liofilizowane estry succinimidylowe Alexa Fluor 594 (AF594) należy zrekonstytuować do stężenia 1mM w buforze do znakowania. W zależności od potrzeb można zastosować inne fluorochromy z serii barwników Alexa Fluor. Od tego momentu należy zminimalizować ekspozycję na światło.
5. Do rozcieńczonego wirusa należy dodać 100μl barwnika AF594 o stężeniu 1mM, delikatnie mieszając końcówką pipety.
6. Mieszaninę reakcyjną do znakowania należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 1hr w ciemności. Co 15mins należy mieszać próbkę poprzez delikatne odwracanie probówki.
7. Probówkę należy krótko wirować w wirówce laboratoryjnej, a następnie do mieszaniny reakcyjnej dodać 100μl odczynnika zatrzymującego, delikatnie mieszając końcówką pipety.
8. Próbkę należy inkubować w temperaturze pokojowej przez kolejną godzinę w ciemności. Co 15mins należy mieszać przez delikatne odwracanie probówki.

2. Oczyszczanie wirusa dengi znakowanego barwnikiem Alexa Fluor

1. W międzyczasie przeprowadź równoważenie kolumny oczyszczającej wybranym buforem. W tym doświadczeniu kolumnę PD-10 równoważy się przed użyciem 25ml buforu HNE (5mM Hepes, 150mM NaCl, 0.1mM EDTA), pH 7.4.
2. Nanieś oznakowany wirus na górę kolumny i rozpocznij zbieranie frakcji przepływowej w momencie, gdy oznakowany wirus wejdzie w macierz. Po całkowitym wniknięciu oznakowanego wirusa w macierz wypełnij kolumnę buforem HNE. Odrzuć pierwsze 2.5ml frakcji przepływowej i zbierz kolejne 2ml frakcji z oznakowanym wirusem.
3. Rozdziel oczyszczonego, oznakowanego AF594 wirusa dengi na alikwoty i przechowuj w temperaturze -80°C, chroniąc przed źródłem światła.

1. Rozmrozić jedną alikwot i oznaczyć miano znakowanego wirusa za pomocą testu plackowego przed użyciem partii znakowanego wirusa.
2. Dzień przed infekcją wysiać 5x10⁴ komórek Vero na dołek w płytce 4-dołkowej z zakryweką na dnie dołka, hodując je w pożywce wzrostowej M-199.
3. Usunąć nadsącz z dołka i zainfekować komórki znakowanym wirusem z wielokrotnością infekcji (MOI) równą 1 w objętości 100μl (rozcieńczonej w pożywce utrzymującej M-199 zgodnie z potrzebami) przez 10min w 37°C.
4. Usunąć inokulaty i dwukrotnie przemyć zakrywki w 1xPBS.
5. Utrwalić komórki w 3% paraformaldehydzie przez 30mins.
6. Przemyć zakrywki 3 razy w 1xPBS.
7. Przeprowadzić permeabilizację komórek za pomocą roztworu do permeabilizacji zawierającego 0,1% saponiny i 5% BSA w 1xPBS przez 30mins.
8. Inkubować komórki z nierozcieńczonym, oczyszczonym przez wirowanie nadsączem z hodowli hybridomy przeciwciała monoklonalnego 3H5 przez 1hr w komorze wilgotnościowej, chroniąc przed światłem.
9. Przemyć zakrywki 3 razy w buforze do mycia (1xPBS zawierającym 1mM chlorku wapnia, 1mM chlorku magnezu i 0,1% saponiny).
10. Inkubować komórki z przeciwciałem AF488 anty-mysie IgG, rozcieńczonym 1:100 w roztworze do permeabilizacji, przez 45mins w komorze wilgotnościowej, chroniąc przed światłem.
11. Przemyć zakrywki 3 razy w buforze do mycia i raz opłukać w wodzie dejonizowanej.
12. Osuszyć krawędź zakrywki ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar wody, i zamontować na szkiełku przedmiotowym za pomocą 8μl Mowiol 4-88 zawierającego 2,5% Dabco.
13. Pozostawić medium montażowe do utwardzenia przez noc w 4°C przed obserwacją przy użyciu konfokalnego mikroskopu Zeiss. Pozyskiwanie obrazów należy przeprowadzać sekwencyjnie, wzbudzając po jednym fluoroforze naraz i jednocześnie przełączając detektory.
14. Obrazy analizuje się następnie pod kątem kolokalizacji barwienia przeciwciałami przeciwko białku E ze znakowanym wirusem przy użyciu oprogramowania Zeiss LSM Zen, aby oszacować stopień znakowania.

3. Reprezentatywne wyniki

Przykład wydajności wirusa dengi znakowanego barwnikiem AF594 przedstawiono na rysunku 2. Zazwyczaj po udanym znakowaniu spadek miana w stosunku do wartości początkowej nie powinien przekraczać 10-krotności. Należy jednak zauważyć, że aby znakowanie przebiegło pomyślnie, wszystkie bufory muszą być przygotowane na świeżo, a estry succinimidylowe Alexa Fluor należy wykorzystać natychmiast po reconstitution, ponieważ w roztworach wodnych hydrolizują one do niereaktywnych wolnych kwasów⁸.

Następnie, przed wykorzystaniem w eksperymentach, należy sprawdzić, czy znakowany wirus wykazuje wystarczającą fluorescencję. Przeprowadzono prosty test immunofluorescencji na komórkach Vero, a stopień znakowania oszacowano na podstawie ko-lokalizacji znakowanego wirusa z barwieniem przeciwciałami przeciwko białku E. Zbadano kilka komórek, a typowy obraz konfokalny przedstawiono na Rysunku 3. Analiza ko-lokalizacji obrazów z wykorzystaniem oprogramowania LSM Zen wykazała współczynniki nakładania w zakresie od 0,65 do 0,8, co sugeruje, że około 65 do 80% wirionów zostało znakowanych barwnikiem.

Rysunek 1. Ogólny schemat procedury znakowania wirusa dengi barwnikiem Alexa Fluor. W pierwszej kolejności przygotowuje się odpowiednie bufory oraz oczyszczonego wirusa dengi. Barwnik Alexa Fluor zostaje zrekonstytuowany i dodany do wirusa dengi rozcieńczonego w buforze do znakowania. Reakcję zatrzymuje się po 1 godzinie poprzez dodanie odczynnika stopującego. Następnie znakowany wirus jest oczyszczany za pomocą kolumny do chromatografii wykluczania cząsteczkowego w celu usunięcia wolnego barwnika. Na koniec znakowany wirus jest ponownie miareczkowany za pomocą metody plackowej i testowany pod kątem fluorescencji.

Rysunek 2. Średnia liczba żywych wirionów (pfu/ml) określona za pomocą metody plackowej przed i po znakowaniu AF594. Alikwot wirusa dengi znakowanego AF594 zostaje rozmrożony i ponownie poddany mianowaniu metodą plackową, co zazwyczaj wykazuje spadek miana poniżej 10-krotności miana początkowego. Słupki błędu oznaczają odchylenie standardowe dla pomiarów powtórzonych.

Rysunek 3. Kolokalizacja znaczników AF594 z białkami E wirusa dengi w komórkach Vero. Komórki hodowane na szkiełkach osłonowych dzień wcześniej zainfekowano wirusem dengi oznakowanym AF594 przy MOI wynoszącym 1 przez 10 minut w temperaturze 37°C. Następnie komórki utrwalono i oznakowano przeciwciałami anty-E, a następnie zbadano kolokalizację białka E (zielony) i oznakowania AF594 (czerwony). Sygnały fluorescencyjne wizualizowano przy powiększeniu 63X przy użyciu konfokalnego mikroskopu Zeiss LSM 710. Pasek skali wynosi 10μm. Kolor żółty wskazuje obszary kolokalizacji, co pokazano na powiększeniu.

Dyskusja

Mimo że w niniejszym raporcie zastosowano barwnik AF594, dostępna jest szeroka gama fluoroforów z serii estrów succinimidylowych Alexa Fluor o podobnej chemii znakowania. Mogłoby to rozszerzyć zastosowania znakowania poza obrazowanie. Cytometria przepływowa może być wykorzystana jako alternatywa dla mikroskopii konfokalnej do szacowania stopnia znakowania fluoroforów, które mogą być wzbudzane i wykrywane przez aparat FACS.

Barwniki Alexa Fluor to małe cząsteczki reagujące z wolnymi grupami ami...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Węglan sodu	Sigma-Aldrich	S6297
Hydroksamina	Sigma-Aldrich	159417
Wodorotlenek sodu	Merck & Co., Inc.	106498
Estry succinimidylowe AF594	Molecular Probes, Life Technologies	A20004
Kolumna PD-10	GE Healthcare	17-0851-01
Hepes	Sigma-Aldrich	H6147
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
M-199	Invitrogen	11150
FBS	Hyclone	SH30070.03
Płytka 4-dołkowa	Nalge Nunc international	176740
Krywinki	Einst	0111520
Przeszkiełko mikroskopowe	Sail Brand	7105
Hybrydoma 3H5	ATCC	HB46
10x PBS		BUF-2040-10X1L	1st Base
Saponina	Sigma-Aldrich	S4521
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	M2670
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	C3306
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	15,812-7
Mowiol 4-88	Calbiochem	475904
Dabco	Sigma-Aldrich	D27802
Wirówka nakładkowa	Eppendorf	5424
Mikroskop konfokalny	Carl Zeiss, Inc.	LSM 710
Aby przygotować pożywkę wzrostową M-199, do 500 ml M-199 dodać 50 ml FBS, 5 ml pirogronianu sodu oraz 5 ml nieistotnych aminokwasów, a następnie przefiltrować sterylnie.
Aby przygotować pożywkę podtrzymującą M-199, do 500 ml M-199 dodać 15 ml FBS, 5 ml pirogronianu sodu oraz 5 ml nieistotnych aminokwasów, a następnie przefiltrować sterylnie.