Wizualizacja wirusa dengi za pomocą etykietowania Alexa Fluor

Summary

Korzystając z postępu w rozwoju technologii fluoroforów i obrazowania, opracowano prostą metodę znakowania wirusa dengi za pomocą Alexy Fluor, aby zobrazować wczesne interakcje między wirusem a komórką.

Abstract

Wczesne zdarzenia w interakcji między wirusem a komórką mogą mieć ogromny wpływ na wynik infekcji. Określanie czynników Wpływ ten może prowadzić do lepszego zrozumienia patogenezy choroby, a tym samym wpłynąć na projekt szczepionki lub terapii. W związku z tym rozwój metod badania tej interakcji byłoby przydatne. Najnowsze osiągnięcia w rozwoju fluoroforów^1-3 i technologii obrazowania⁴ można wykorzystać do Poszerzenie naszej obecnej wiedzy na temat patogenezy gorączki denga, a tym samym utorowanie drogi do zmniejszenia liczby milionów zakażeń gorączką denga występujących rocznie.

Otoczkowy wirus dengi ma zewnętrzne rusztowanie składające się z 90 otoczek dimerów glikoproteiny (E) chroniących otoczkę nukleokapsydu, który zawiera pojedynczą dodatnią nić genomu RNA⁵. Identyczne podjednostki białkowe na powierzchni wirusa można w ten sposób znakować barwnikiem reagującym z aminami i wizualizować za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę znakowania wirusa dengi barwnikiem estrowym Alexa Fluor succinimidyl upuszczonym bezpośrednio w sodu Bufor wodorowęglanowy, który po znakowaniu dał wysoce żywotnego wirusa. Nie ma ustandaryzowanej procedury oznaczania żywego wirusa i istniejącego protokołu producenta Do znakowania białek zwykle wymaga odtworzenia barwnika w dimetylosulfotlenku. Obecność dimetylosulfotlenku, nawet w niewielkich ilościach, może blokować produktywne zakażenie wirusem, a także indukować cytotoksyczność komórek⁶. Wykluczenie stosowania dimetylosulfotlenku w tym protokole zmniejszyło zatem tę możliwość. Barwniki Alexa Fluor mają doskonałą fotostabilność i są mniej wrażliwe na pH niż zwykłe barwniki, takie jak fluoresceina i rodamina², dzięki czemu idealnie nadają się do badania nad wychwytem komórkowym i transportem endosomalnym wirusa. Koniugacja barwnika Alexa Fluor nie wpłynęła na rozpoznawanie znakowanej dengi wirusa przez przeciwciało specyficzne dla wirusa i jego domniemane receptory w komórkach gospodarza⁷. Metoda ta może mieć użyteczne zastosowanie w badaniach wirusologicznych.

Protocol

1. Oznakowanie wirusa dengi Alexa Fluor

1. Przed reakcją znakowania należy oczyścić wirusa dengi za pomocą poduszki sacharozowej i przygotować niezbędne odczynniki i sprzęt, jak wskazano w protokole.
2. Przygotuj świeży 0,2 M bufor wodorowęglanu sodu o pH 8,5 (bufor do znakowania) i 1,5 M bufor hydroksyloaminy, pH 8,3 (odczynnik zatrzymujący), tuż przed etykietowaniem i filtrowaniem Sterylizuj za pomocą filtrów strzykawkowych 0,2 μm.
3. Rozcieńczyć około 3x10⁸ jednostek tworzących płytkę (pfu) oczyszczonego wirusa dengi w 1 ml buforu do znakowania w probówce o pojemności 2 ml. Można to proporcjonalnie zwiększyć w celu etykietowania partii wirusa.
4. Rozpuść liofilizowane estry sukcynimidylowe Alexa Fluor 594 (AF594) do 1 mM w buforze znakującym bezpośrednio przed reakcją znakowania. Inne fluorochromy z serii barwników Alexa Fluor mogą być stosowane w zależności od potrzeb. Począwszy od tego etapu, zminimalizuj ekspozycję na światło.
5. Do rozcieńczonego wirusa dodać 100 μl barwnika 1mM AF594, delikatnie mieszając końcówką pipety.
6. Inkubować mieszaninę reakcyjną znakowania w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności. Mieszaj przez delikatne inwersje co 15 minut.
7. Krótko zakręć probówką w wirówce stołowej i dodaj 100 μl odczynnika zatrzymującego do mieszaniny reakcyjnej, delikatnie mieszając końcówką pipety.
8. Inkubować w temperaturze pokojowej przez dodatkową godzinę w ciemności. Mieszaj przez delikatne inwersje co 15 minut.

2. Oczyszczanie wirusa dengi znakowanego Alexa Fluor

1. W międzyczasie zrównoważyć kolumnę oczyszczającą z wybranym buforem. W tym eksperymencie kolumna PD-10 jest równoważona z 25 ml buforu HNE (5 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA), pH 7,4, przed użyciem.
2. Nałóż oznakowanego wirusa na górę kolumny i zacznij zbierać przepływ, gdy oznakowany wirus dostanie się do matrycy. Wypełnij kolumnę buforem HNE Gdy cały oznaczony wirus dostanie się do matrycy. Wyrzuć pierwsze 2,5 ml przepływu i zbierz następne 2 ml znakowanej frakcji wirusa.
3. Porcję i przechowywać oczyszczony wirus dengi znakowany AF594 w temperaturze -80°C, z dala od źródła światła.

1. Rozmrozić jedną podwielokrotność i określić miano znakowanego wirusa za pomocą testu płytkiowego przed użyciem partii znakowanego wirusa.
2. Wysiew 5x10⁴ na dołek komórek Vero, wyhodowanych w pożywce wzrostowej M-199, na 4-dołkowej płytce z szkiełkiem nakrywkowym na dnie dołka dzień przed zakażeniem.
3. Usunąć supernatant hodowli do studzienki i zainfekować komórki wielokrotnym zakażeniem 1 znakowanego wirusa w objętości 100 μl (rozcieńczonej w pożywce konserwacyjnej M-199 zgodnie z wymaganiami) przez 10 minut w temperaturze 37°C.
4. Usunąć inokulum i umyć szkiełka nakrywkowe dwukrotnie w 1xPBS.
5. Utrwal komórki w 3% paraformalydehyde przez 30 minut.
6. Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy w 1xPBS.
7. Przepuszczalność komórek roztworem permeabilizacyjnym zawierającym 0,1% saponiny i 5% BSA w 1xPBS przez 30 minut.
8. Inkubować komórki z nierozcieńczonym supernatantem 3H5 z przeciwciałem monoklonalnym 3H5 przez 1 godzinę w wilgotnej komorze, chronionej przed światłem.
9. Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy w buforze do płukania (1xPBS zawierający 1mM chlorku wapnia, 1mM chlorku magnezu i 0,1% saponiny).
10. Inkubować komórki z mysim przeciwciałem IgG AF488, rozcieńczonym w stosunku 1:100 w roztworze przepuszczalnym, przez 45 minut w wilgotnej komorze, chronionej przed światłem.
11. Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy w buforze do płukania i spłucz raz w wodzie dejonizowanej.
12. Przetrzyj krawędź szkiełka nakrywkowego o ręcznik papierowy, aby odsączyć nadmiar wody i zamontuj na szkiełku podstawowym z 8 μl Mowiol 4-88 zawierającego 2,5% Dabco.
13. Poczekaj, aż roztwór montażowy zastygnie przez noc w temperaturze 4°C przed viewza pomocą mikroskopu konfokalnego Zeiss. Akwizycje sekwencyjne powinny być wykonywane z ekscytacją po jednym fluoroforze na raz i równoczesnym przełączaniem między detektorami.
14. Obrazy są następnie analizowane pod kątem kolokalizacji barwienia przeciwciałami białka E ze znakowanym wirusem za pomocą oprogramowania Zeiss LSM Zen w celu oszacowania stopnia znakowania.

3. Reprezentatywne wyniki

Przykład wydajności wirusa dengi oznaczonego barwnikiem AF594 pokazano na rysunku 2. Zwykle po pomyślnym znakowaniu należy zaobserwować mniejszy niż 10-krotny spadek w stosunku do początkowego miana. Należy jednak zauważyć, że wszystkie muszą być przygotowane na świeżo, aby etykietowanie zakończyło się sukcesem, a estry sukcynimidylu Alexa Fluor należy zużyć natychmiast po rozpuszczeniu, ponieważ hydrolizują do niereaktywnych wolnych kwasów w roztworach wodnych⁸.

Następnie, oznakowany wirus musi zostać sprawdzony pod kątem wystarczającej fluorescencji przed użyciem w eksperymentach. Przeprowadzono prosty test immunofluorescencyjny na komórkach Vero, a stopień znakowania można oszacować na podstawie kolokalizacji znakowanego wirusa z barwieniem przeciwciałami anty-E białka. Zbadano kilka komórek, a typowy obraz konfokalny pokazano na rycinie 3. Analiza kolokalizacyjna obrazów przy użyciu oprogramowania LSM Zen wykazała współczynniki nakładania się w zakresie od 0,65 do 0,8, co sugeruje, że około 65 do 80% wirionów zostało znakowanych barwnikiem.

Rysunek 1. Ogólny schemat przedstawiający procedurę znakowania wirusa dengi barwnikiem Alexa Fluor. Najpierw przygotowuje się odpowiednie i oczyszczony wirus dengi. Barwnik Alexa Fluor jest odtwarzany i dodawany do wirusa dengi rozcieńczony w buforze znakującym. Reakcja zostaje następnie zatrzymana 1 godzinę później przez dodanie odczynnika stop. Następnie oznakowany wirus jest oczyszczany przez kolumnę wykluczającą rozmiar w celu usunięcia wolnego barwnika. Na koniec znakowany wirus jest ponownie miareczkowany za pomocą testu płytkiowego i testowany pod kątem fluorescencji.

Rysunek 2. Średnia liczba żywotnych wirionów (pfu/ml) określona w teście płytki nazębnej przed i po znakowaniu AF594. Podwielokrotność wirusa dengi znakowanej AF594 jest rozmrażana i ponownie miareczkowana za pomocą testu płytki nazębnej i zwykle wykazuje mniejszy niż 10-krotny spadek w stosunku do początkowego miana. Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe duplikatów.

Rysunek 3. Kolokalizacja znaczników AF594 z białkami E wirusa dengi w komórkach Vero. komórki wyhodowane na szkiełkach nakrywkowych dzień wcześniej zostały zakażone dengą znakowaną AF594 w MOI 1 przez 10 minut w temperaturze 37°C. Komórki zostały następnie utrwalone i znakowane przeciwciałem anty-E i zbadane pod kątem kolokalizacji białka E (zielony) i znakowania AF594 (czerwony). Sygnały fluorescencyjne zostały zobrazowane pod 63-krotnym powiększeniem za pomocą mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 710. Pasek skali wynosi 10 μm. Kolor żółty oznacza obszary kolokalizacji, jak pokazano we wstawce.

Discussion

Chociaż w tym raporcie użyto barwnika AF594, dostępna jest szeroka gama fluoroforów z serii estrów sukcynimidylowych Alexa Fluor o podobnej chemii etykietowania. Może to rozszerzyć aplikację do etykietowania poza obrazowanie. Cytometria przepływowa może być stosowana jako alternatywa dla mikroskopii konfokalnej do oszacowania stopnia znakowania fluoroforów, które mogą być wzbudzone i wykryte przez maszynę FACS.

Barwniki Alexa Fluor to małe cząsteczki, które reagują z wolnymi grupami aminowymi,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	S6297
Hydroksyloamina	Sigma-Aldrich	159417
Wodorotlenek sodu	Merck & Co., Inc.
AF594 estry sukcynimidylowe	Sondy molekularne, Life Technologies	A20004
Kolumna PD-10	GE Healthcare	17-0851-01
Hepes	Sigma-Aldrich	H6147
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
M-199	Invitrogen	11150
	FBS Hyclone	SH30070.03
Płytka 4-dołkowa	Nalge Nunc international	176740
Szkiełka nakrywkowe	Einst	0111520
Szkiełko mikroskopowe	Marka	żagla 7105
3H5 hybridoma	ATCC	HB46
10x PBS		BUF-2040-10X1L	1. baza
Saponin	Sigma-Aldrich	S4521
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	M2670
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	C3306
Paraformaldehye	Sigma-Aldrich	15,812-7
Mowiol 4-88	Calbiochem	475904
Dabco	Sigma-Aldrich	D27802
Wirówka stołowa	Eppendorf	5424
Mikroskop konfokalny	Carl Zeiss, Inc.	LSM 710
Aby przygotować pożywkę wzrostową M-199, dodaj 50ml FBS, 5ml pirogronianu sodu i 5ml aminokwasów endogennych do 500ml M-199, sterylny filtr.
Aby przygotować pożywkę konserwacyjną M-199, dodaj 15ml FBS, 5ml pirogronianu sodu i 5ml aminokwasów endogennych do 500ml M-199, sterylnego filtra.