Dożylne podawanie blokerów receptorów w celu zmniejszenia obrzęku mózgu w modelu mysim

Streszczenie

Źródło: Zeynalov, E. et al., Ciągły wlew dożylny jest wybraną drogą leczenia blokera receptora argininy-wazopresyny koniwaptanu u myszy w celu zbadania obrzęku mózgu wywołanego udarem. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje dożylne podawanie antagonisty receptora argininy-wazopresyny (AVP) w modelu mysim. Przejściowe zamknięcie tętnicy środkowej mózgu wywołuje obrzęk mózgu. Antagonista receptora AVP jest podawany przez cewnik w lewej żyle szyjnej, łagodząc obrzęk.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Indukcja udaru in vivo

Wstępnie

1. pokryj włókno żywicą dentystyczną przed zabiegiem.
   1. Wytnij kawałek filamentu o długości 12 mm z nylonowego szwu 7-0. Wymieszaj 2 części żywicy z 1 częścią utwardzacza, a następnie natychmiast zanurz końcówkę filamentu w mieszance, aby pokryć około 1/3 całej długości. Usuń go szybko i sprawdź, czy jest pokryty gładką warstwą żywicy dentystycznej.
   2. Suszyć filament na powietrzu przez 2 godziny przed użyciem.
2. Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia (objętość 2 l) i ustaw przepływ 1,5% izofluranu w 25% wzbogaconym w tlen powietrzu w pomieszczeniu na 2 l/min wpływający do komory.
3. Pozwól myszy pozostać w komorze indukcyjnej do całkowitego znieczulenia, zgodnie z brakiem reakcji na uszczypnięcie ogona.
4. Umieść mysz na stole operacyjnym z podgrzewaną podkładką i ustaw stężenie izofluranu na 1% w celu podtrzymania znieczulenia podawanego spontanicznie przez stożek nosowy.
5. Przypnij włosy z przodu i z tyłu szyi i spryskaj szyję alkoholem. Nałóż weterynaryjną maść okulistyczną na oba oczy.
6. Aby stale monitorować temperaturę ciała, podczas operacji należy używać sondy temperatury doodbytniczej podłączonej do wyświetlacza cyfrowego.
7. Umieść mysz w pozycji leżącej, nałóż 10% roztwór do peelingu z jodonem powidonu do dezynfekcji, przykryj sterylną serwetą, a następnie wykonaj nacięcie w linii środkowej wzdłuż szyi za pomocą chirurgicznego ostrza skalpela w rozmiarze 10.
8. Tymczasowo podwiązać lewą tętnicę szyjną wspólną (CCA) za pomocą szwu jedwabnego 6,0.
9. Umieść kolejną opaskę na lewej tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA).
10. Umieść klips mikronaczyniowy na tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA).
11. Wytnij mały otwór na tętnicy szyjnej zewnętrznej nożyczkami mikronaczyniowymi. Włóż filament wykonany z nylonowego szwu 7-0 pokrytego żywicą dentystyczną do otworu w ECA i przesuwaj go głowo, jednocześnie wyjmując klips, aż do wyczucia oporu (około 5-7 mm od punktu rozwidlenia CCA).
12. Umieść tymczasowe wiązanie na tętnicy szyjnej wewnętrznej, aby zabezpieczyć włókno na miejscu. Patrz schemat, rysunek 1A. Zamknąć skórę jedwabnym szwem i naciekać ranę z przodu szyi 0,2 ml 0,5% bupiwakainy, jak w kroku 2.6.
13. Pozwól myszy obudzić się ze znieczulenia i odzyskać przytomność w komorze regeneracyjnej przez 60 minut. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.
14. Przetestuj mysz pod kątem oceny deficytu neurologicznego (NDS) w następujący sposób: 0 = normalna funkcja motoryczna, 1 = zgięcie tułowia i przeciwległej kończyny przedniej przy uniesieniu ogonowym, 2 = krążenie w stronę przeciwległą, ale normalna postawa w spoczynku, 3 = pochylanie się na przeciwległą stronę w spoczynku, 4 = brak spontanicznej aktywności motorycznej.
    1. Aby przeprowadzić testy NDS, podnieś mysz za ogon i umieść ją na płaskiej powierzchni do obserwacji (2-3 min). Alternatywnie, obserwuj myszy w komorze regeneracyjnej. Wyklucz z eksperymentu myszy, które wykazują NDS niższy niż 2 z powodu niewystarczającej niedrożności środkowej tętnicy szyjnej (MCA).
       UWAGA: Technika laserowej przepływomierza dopplerowskiego może być użyta do potwierdzenia okluzji MCA.
15. Ponownie znieczulić zwierzę po 60 minutach rekonwalescencji w komorze indukcyjnej, jak opisano powyżej, ponownie wysterylizować poprzednie nacięcie skóry 10% roztworem peelingu powidonowo-jodowego i ponownie otworzyć ranę chirurgiczną z przodu szyi, przecinając i usuwając szew jedwabny.
16. Aby wyjąć filament z ECA, wykonaj następujące czynności:
    1. Umieść klips mikronaczyniowy na ICA. Rozwiąż szew na ICA i wyciągnij filament, trzymając klips otwarty.
    2. Zamknij klips i umieść krawat na ECA proksymalnie do nacięcia.
    3. Usuń klips i ligaturę z CCA, aby przywrócić przepływ krwi do mózgu. Patrz schemat, rysunek 1B.

2. Instalacja cewnika dożylnego (IV) do żyły szyjnej w celu ciągłego leczenia przez 48 godzin

UWAGA: Przystąp do instalacji cewnika natychmiast po kroku 1.16.3 bez budzenia myszy.

1. Używaj dwóch różnych rozmiarów elastycznych przewodów: włóż rurkę wewnętrzną (średnica zewnętrzna 0,94 mm; aby pomieścić podawany lek) do rurki zewnętrznej (średnica zewnętrzna 3,18 mm; w celu ochrony rurki wewnętrznej).
2. Umieść mysz w pozycji leżącej, nałóż 10% roztwór peelingujący z jodonem powidonu do dezynfekcji i wykonaj 1 cm nacięcie z tyłu szyi za pomocą ostrza skalpela chirurgicznego w rozmiarze 10. Obróć mysz do pozycji leżącej, ponownie wysterylizuj przód szyi 10% roztworem peelingu jodowidonowego i ponownie otwórz ranę pooperacyjną z przodu szyi. Przedrążyć rurkę pod skórą od nacięcia wykonanego z tyłu do przodu szyi i wyprowadzić ją na zewnątrz od otwartej rany na 1 cm.
3. Usuń podskórną tkankę tłuszczową z lewej strony przedniej części szyi około 1 cm w bok od linii środkowej. Zlokalizuj lewą żyłę szyjną, umieść dwie opaski wzdłuż żyły w odległości 5 mm od siebie i lekko rozciągnij żyłę. Zrób mały otwór w żyle szyjnej między dwoma krawatami za pomocą nożyczek mikronaczyniowych; Włóż końcówkę rurki wewnętrznej na głębokość 5 mm doogonowo (w kierunku serca).
4. Przymocuj rurkę obiema opaskami do żyły szyjnej. Zamknij skórę z przodu szyi za pomocą jedwabnego szwu 3-0. Patrz schemat, rysunek 1C.
5. Przymocuj rurkę do skóry z tyłu szyi za pomocą szwu i podłącz rurkę do pompy dożylnej do mikroinfuzji za pomocą krętlika. Krętlik umożliwia swobodne przemieszczanie się myszy wewnątrz klatki z pełnym dostępem do pokarmu i wody.
6. Naciekać nacięcia skóry z przodu i z tyłu szyi za pomocą 0,2 ml 0,5% bupiwakainy, aby zapobiec bólowi pooperacyjnemu.
   UWAGA: W zależności od instytucjonalnych protokołów na zwierzętach, zwierzęta mogą być leczone opioidami, niesteroidowymi lekami przeciwzapalnymi (NLPZ) lub antybiotykami przed i po operacji. Jednak wymienione metody leczenia mogą zmienić wyniki udaru niedokrwiennego.
7. Pozwól zwierzęciu obudzić się w komorze rekonwalescencji, a następnie umieść je w oddzielnej klatce do momentu zakończenia eksperymentu. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.
8. Ustawić szybkość infuzji dla ciągłego 48-godzinnego leczenia dożylnego koniwaptanem (0,14 mg/ml w 5% dekstrozie) lub podłożem na poziomie 1,5 ml/kg mc./godz. i rozpocząć infuzję.
   UWAGA: Całkowita ilość koniwaptanu podawanego dożylnie powinna wynosić około 0,2 mg/mysz/dobę w całkowitej objętości 1,44 ml.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat eksperymentalnego modelu udaru, instalacja cewnika dożylnego i reprezentatywna objętość zawału po 48 godzinach od udaru. Położenie włókna (pokazanego na niebiesko) wstępnie pokrytego żywicą (zielony) w lewej tętnicy szy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Podgrzewana podkładka	K&H Manufacturing Inc	1060
Monitor temperatury z sondą doodbytniczą	Physitemp	7029
Szpula do szwów jedwabnych, 6-0	Surgical Specialties Corporation	SP114
Jedwabny szew na igle, 3-0	Ethicon	1684G
Szew nylonowy, 7-0	Ethicon	1696G
Żywica dentystyczna polisiloksan z utwardzaczem	Heraeus Kulzer	65817930
Pompa dożylna do mikroinfuzji	Kent Scietific	GT0897
Krętlik 22GA	Instech	375/22PS
Rurki laboratoryjne, 0.94 x 0.51 mm	Dow Corning	508-002
Rurki laboratoryjne, 3.18 x 1.98 mm	Dow Corning	508-009