Metylacja DNA: modyfikacja i analiza wodorosiarczynów

Summary

Złotym standardem analizy metylacji DNA jest sekwencjonowanie genomowe DNA przekształconego w wodorosiarczyn. Metoda ta wykorzystuje zwiększoną wrażliwość cytozyny w porównaniu z 5-metylocytozyną (5-MeC) na deaminację wodorosiarczynową w warunkach kwaśnych. Cytozyny niemetylowane można odróżnić od cytozyn metylowanych po amplifikacji PCR docelowego genomowego DNA.

Abstract

Epigenetyka opisuje dziedziczne zmiany w funkcjonowaniu genów, które zachodzą niezależnie od sekwencji DNA. Molekularne podstawy epigenetycznej regulacji genów są złożone, ale zasadniczo obejmują modyfikacje samego DNA lub białek, z którymi DNA się łączy. Dominującą modyfikacją epigenetyczną DNA w genomach ssaków jest metylacja nukleotydów cytozyny (5-MeC). Metylacja DNA dostarcza maszynerii ekspresji genów instrukcji dotyczących tego, gdzie i kiedy gen powinien ulec ekspresji. Główną sekwencją docelową metylacji DNA u ssaków są dinukleotydy 5'-CpG-3' (ryc. 1). Dinukleotydy CpG nie są równomiernie rozmieszczone w całym genomie, ale są skoncentrowane w regionach powtarzalnych sekwencji genomowych i "wyspach" CpG powszechnie związanych z promotorami genów (Figura 1). Wzorce metylacji DNA są ustalane na wczesnym etapie rozwoju, modulowane podczas różnicowania specyficznego dla tkanek i zaburzone w wielu stanach chorobowych, w tym w raku. Aby zrozumieć biologiczną rolę metylacji DNA i jej rolę w chorobach u ludzi, potrzebne są precyzyjne, wydajne i powtarzalne metody wykrywania i ilościowego określania poszczególnych 5-MeC.

Ten protokół konwersji wodorosiarczynu jest "złotym standardem" dla analizy metylacji DNA i ułatwia identyfikację i kwantyfikację metylacji DNA w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu. Chemia deaminacji cytozyny przez wodorosiarczyn sodu składa się z trzech etapów (ryc. 2). (1) Sulfonacja: Dodanie wodorosiarczynu do podwójnego wiązania 5-6 cytozyny (2) Deaminacja hydrolityczna: deaminacja hydrolityczna otrzymanej pochodnej cytozyno-wodorosiczynowej w celu uzyskania pochodnej uracylu-wodorosiczynu (3) Odsulfonacja alkaliczna: Usunięcie grupy sulfonianowej przez obróbkę alkaliczną w celu uzyskania uracylu. Wodorosiarczyn preferencyjnie deaminuje cytozynę do uracylu w jednoniciowym DNA, podczas gdy 5-MeC jest oporny na deaminację za pośrednictwem wodorosiarczynu. Po amplifikacji PCR uracyl jest amplifikowany jako tymina, podczas gdy reszty 5-MeC pozostają jako cytozyny, co pozwala na odróżnienie metylowanych CpG od niemetylowanych CpG na podstawie obecności reszty cytozyny "C" w porównaniu z resztą "T" tyminy podczas sekwencjonowania.

Modyfikacja DNA przez konwersję wodorosiarczynu jest dobrze znanym protokołem, który może być wykorzystany do wielu metod analizy metylacji DNA. Ponieważ wykrycie 5-MeC przez konwersję wodorosiarczynu zostało po raz pierwszy zademonstrowane przez Frommera i wsp.¹ oraz Clark i wsp.², metody oparte na konwersji wodorosiarczynów genomowego DNA stanowią większość nowych danych na temat metylacji DNA. Można stosować różne metody analizy post PCR, w zależności od wymaganego stopnia swoistości i rozdzielczości metylacji. Klonowanie i sekwencjonowanie jest nadal najłatwiej dostępną metodą, która może zapewnić rozdzielczość pojedynczego nukleotydu do metylacji w całej cząsteczce DNA.

Protocol

Protokół konwersji wodorosiarczynu

Standardowy protokół konwersji 2 μg genomowego DNA jest opisany poniżej. Mniejsze lub większe ilości genomowego DNA (100 pg-200 μg) mogą być również z powodzeniem poddane obróbce wodorosiarczynowej. Te warunki reakcji skutkują całkowitą konwersją (99,5-99,7%) prawie każdej docelowej sekwencji^{DNA 3}.

1. Przygotowanie DNA

Przygotuj próbki poprzez inkubację genomowego DNA z bisiarczynowym buforem do lizy DNA (2 μg tRNA, 280 ng/μl Proteinaza K, 1% SDS) w całkowitej objętości 18 μl przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Uwaga: Jest to ważne dla osiągnięcia maksymalnej konwersji wodorosiarczynu, szczególnie w przypadku DNA wyizolowanego z próbek klinicznych, gdzie nadal może istnieć białko związane z DNA.

2. Denaturacja DNA

1. Denaturować 2 μg DNA w objętości 20 μl przez dodanie 2 μl świeżo przygotowanego 3M NaOH do końcowego stężenia 0,3M.
2. Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w łaźni wodnej, a następnie inkubować w temperaturze 90 °C przez 2 minuty w bloku grzewczym. Natychmiast umieść probówki na lodzie na 5 minut.
3. Odwirować probówki w temperaturze 4°C przez 10 s w temperaturze 10 000 g, aby upewnić się, że DNA znajduje się na dnie probówki.

3. Deaminacja wodorosiarczynu

Sulfonacja i deaminacja hydrolityczna

1. Przygotować świeże roztwory 10 mM chinolu i nasyconego pirosiarczynu sodu o pH 5,0 (7,6 g Na₂S₂O₅ z 464 μl 10 M NaOH, uzupełnione wodą do 15 ml). Roztwór nasyconego wodorosiarczynu sodu uzyskuje się przez delikatne odwrócenie mieszaniny odczynnika/_H2O, przy minimalnym wymieszaniu i napowietrzeniu. W razie potrzeby dostosować pH za pomocą 10 M NaOH w celu całkowitego rozpuszczenia pirosiarczynu. Uwaga: Ponieważ jest to roztwór nasycony, małe grudki mogą nadal pozostać nierozpuszczone.
2. Dodać 208 μl nasyconego pirosiarczynu i 12 μl 10 mM chinolu do zdenaturowanego DNA (20 μl), w końcowej objętości 240 μl, do końcowego stężenia 2,31 M wodorosiarczynu/0,5 mM chinolu, pH 5,0. Delikatnie wymieszaj wszystkie odczynniki i odwiruj przez 10 sekund, aby upewnić się, że wszystkie kropelki znajdują się na dnie probówki.
3. Na próbki nałożyć 200 μl oleju mineralnego. Próbki należy inkubować w temperaturze 55°C w łaźni wodnej przez 4-16 godzin. Czas trwania obróbki wodorosiarczynem zależy od ilości i jakości DNA, które ma zostać przekształcone. W przypadku DNA złej jakości lub zdegradowanego DNA należy ograniczyć czas inkubacji do 4 godzin. Uwaga: ważne jest, aby konwersja wodorosiarczynu odbywała się w ciemności, aby uniknąć utleniania, więc jeśli nie jest to możliwe, owiń probówki folią przed inkubacją.
4. Pod koniec odpowiedniego czasu inkubacji należy krótko obrócić probówki w mikrowirówce, aby upewnić się, że cały płyn znajduje się na dnie probówki.
5. Odzyskać DNA poddane działaniu wodorosiarczynu spod warstwy oleju, ostrożnie odpipetowując roztwór DNA z dna probówki, nie pobierając żadnej części oleju mineralnego.

Odsalanie

5. Usunąć wszelkie wolne jony wodorosiarczynowe, przechodząc przez kolumnę odsalającą i eluując w 50 μl wody mili-Q (MQH₂O). W zależności od ilości i jakości genomowego DNA oraz sposobu jego przygotowania, można stosować różne kolumny odsalające. Rutynowo używamy kolumn Promega Wizard Clean-up, ponieważ są one odpowiednie do usuwania SDS używanego do przygotowania DNA przed konwersją.

Odsiarczanie alkaliów

6. Addukt wodorosiarczynowy jest usuwany z pierścienia uracylu przez odsulfonowanie. Odsulfonian przez dodanie 5,5 μl świeżo przygotowanego 3M NaOH do końcowego stężenia 0,3M, następnie inkubować próbki w temperaturze 37°C przez 15 minut.
7. Krótko odwirować i dodać 1 μl tRNA (10 mg/ml).
8. Zneutralizować roztwór przez dodanie 33 μl octanu amonu (NH₄O Ac), pH 7,0 do końcowego stężenia 3M.
9. Etanol - wytrącić DNA, dodając 330 μl lodowatego 100% etanolu, dobrze wymieszać przez inwersję. Pozostaw w temperaturze -20 μC na 1 godzinę do nocy. Wirować przy 14 000 g przez 15 minut w temperaturze 4°C. Usunąć wszelkie ślady supernatantu i wysuszyć wytrącone DNA na powietrzu przez ~20 minut.
10. Ponownie zawiesić osad DNA w 50 μl/μg 0,1 TE (10mM Tris-HCL, 0,1mM EDTA, pH 8,0) lub_H2O. Pozostaw w temperaturze pokojowej na około 2 godziny. Od czasu do czasu wiruj probówki, aby upewnić się, że DNA się rozpuściło, a następnie szybko odwiruj.
11. Zużyć natychmiast do amplifikacji PCR lub przechowywać w temperaturze -20°C przez 1-10 lat, w zależności od ilości i jakości DNA.

4. Amplifikacja PCR

Projekt podkładu

1. Skuteczne zaprojektowanie starterów swoistych dla konwersji wodorsiarczynu PCR ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia wydajnej, bezstronnej amplifikacji całkowicie przekształconego DNA. Poniższe wskazówki służą do wspomagania projektowania podkładu.

Wytyczne dotyczące projektowania podkładów

Termocyling

2. Aby przetestować proporcjonalną amplifikację PCR metylowanego i niemetylowanego DNA, należy użyć próbki kontrolnej 50:50 w pełni konwersji wodorosiarczynu w proporcji 50:50 i amplifikować starterami specyficznymi dla konwersji wodorosiarczynu w zoptymalizowanych warunkach reakcji PCR (Figura 3). W przypadku kontroli 50:50 metylowanej: niemetylowanej należy użyć zmetylowanego DNA SssI in vitro i DNA z amplifikacją całego genomu (WGA) lub DNA z krwi pełnej. Należy pamiętać, że niektóre geny będą naturalnie metylowane we krwi i dlatego w takich przypadkach najlepiej jest używać tylko DNA WGA jako "niemetylowanej" kontroli.
3. Przygotować mieszaniny reakcyjne amplifikacji PCR w 100 μl podwielokrotnościach zawierających 2 μl genomowego DNA przekształconego w wodorosiarczyn, 200 μM dNTP, 1 μM startery, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCL, pH 8,3 i 0,15 μl polimerazy Taq.
4. W termocyklerze z gradientem temperatury ustaw reakcję przebiegu w gradiencie +/- 3°C od przewidywanej Tm startera na 10 probówkach

5. Aby sprawdzić, czy metylowane i niemetylowane amplikony zostały amplifikowane proporcjonalnie, amplikon może być trawiony za pomocą informacyjnego enzymu restrykcyjnego, takiego jak Taq 1 (TCGA), który trawi metylowane DNA, ale nie trawi niemetylowanego DNA, gdy miejsce enzymu restrykcyjnego ulega zmianie po konwersji wodorosiarczynu do TTGA. Stopień trawienia można uwidocznić za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (ryc. 3A). Alternatywnie do reakcji PCR można dodać SYBRGreen (0,2 μl rozcieńczenia 1:1000), a zakres metylacji można ocenić, wykonując wykresy dysocjacji ciepła w termocyklerze PCR w czasie rzeczywistym (Figura 3B).
6. Mieszanina reakcyjna PCR, w tym stężenie MgCl₂ i warunki termocyklingu, może wymagać dostosowania w celu zwiększenia wydajności PCR lub zapewnienia proporcjonalnej amplifikacji PCR metylowanych i niemetylowanych fragmentów PCR.
7. Po zoptymalizowaniu warunków PCR można przeprowadzić amplifikację PCR na próbkach przekształconych w wodorosiarczyn. Uwaga: Po zoptymalizowaniu Tm nie trzeba stosować PCR z gradientem temperatury.

5. Reprezentatywne wyniki:

Przykład optymalizacji amplifikacji bisulfitynowego PCR pokazano na rysunku 3. Optymalne warunki amplifikacji PCR powinny amplifikować metylowane i niemetylowane amplikony proporcjonalnie i bez stronniczości. Rysunek 3A przedstawia żel agarozowy z profilem amplifikacji PCR w gradieniu temperatury, z mieszaniny 50% metylowanego i niemetylowanego DNA. Amplikony PCR zostały potraktowane enzymem restrykcyjnym, Taq 1 (TCGA), który trawi metylowane (M) DNA, ale nie trawi niemetylowanego (U) DNA, ponieważ miejsce enzymu restrykcyjnego jest zmieniane przez konwersję wodorosiarczynu do TTGA. Oczekuje się, że taka sama ilość pociętego i niepociętego produktu PCR zostanie amplifikowana proporcjonalnie, jeśli metylowane i niemetylowane DNA zostanie amplifikowane. Na tym żelu widać, że optymalne warunki termocylingu dla wzmocnienia bez odchylenia wynoszą 56,1°C (T). Całkowita konwersja wodorosiarczynowego DNA może być również analizowana przez trawienie enzymem specyficznym dla miejsca cytozyny, takim jak HpaIII (CCGG). Hpa (Hpa)III zostanie przetrawiony tylko wtedy, gdy konwersja nie powiodła się, ponieważ witryna ograniczeń zostanie zachowana. Jeśli konwersja zostanie zakończona, miejsce restrykcji zostanie przekształcone w TCGG lub TTGG w zależności od stanu metylacji DNA. Pełną konwersję wodorosiarczynowego DNA można zobaczyć na rysunku 3A (H).

Rysunek 3B pokazuje wykres dysocjacji w czasie rzeczywistym, który może być również użyty jako narzędzie do określenia, czy istnieje jakiekolwiek odchylenie amplifikacji na podstawie temperatury, w której różne cząsteczki będą dysocjować. Na tym rysunku widać, że PCR ma amplifikowane metylowane (M) i niemetylowane (U) DNA proporcjonalnie z mieszanki 50% metylowanego i niemetylowanego DNA w porównaniu z kontrolną amplifikacją w pełni metylowanego i niemetylowanego DNA, które dysocjują odpowiednio w 82,1 μC i 78,9 μC.

Po optymalizacji termocyklingu i warunków reakcji, próbki traktowane wodorosiarczynem mogą być wzmacniane za pomocą starterów specyficznych dla nici i wodorosiarczynów w pojedynczej lub częściowo zagnieżdżonej reakcji PCR. Powstałe fragmenty PCR można uwidocznić za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i sekwencjonować bezpośrednio (Figura 4A) lub przez klonowanie i sekwencjonowanie. Po sklonowaniu i sekwencjonowaniu stan metylacji poszczególnych cząsteczek można przedstawić w tabeli na mapie wodorosiarczynowej (ryc. 4B), aby zobrazować niejednorodność metylacji.

Wysokoprzepustowa ilościowa analiza metylacji może być przeprowadzona przy użyciu technologii takiej jak ta stosowana metodą Sequenom EpiTYPER. Korzystając z tej metody, DNA przekształcone w wodorosiarczyn jest amplifikowane starterami PCR specyficznymi dla wodorosiarczynu, a następnie następuje właściwy proces rozszczepienia. Powstałe fragmenty są oznaczane ilościowo za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF o specyficznym spektrum zależnym od obecności metylowanych cytozyn (ryc. 5A). Podsumowanie stosunków metylacji w próbce można następnie ekstrapolować w postaci epigramu (rysunek 5B) lub wykresu metylacji (rysunek 5C).

Rysunek 1. Schemat metylowanego CpG. W normalnej komórce wyspy CpG związane z promotorem są przeważnie niemetylowane (szare), podczas gdy miejsca CpG w ciałach genowych są rzadkie i na ogół metylowane (czerwone). Panel po prawej stronie rozszerza strukturę molekularną DNA w pojedynczym miejscu CpG i pokazuje metylację cząsteczką CH3 przy węglu 5 cytozyny.

Rysunek 2. Schemat konwersji chemicznej. Analiza metylacji DNA obejmuje cztery główne etapy, jak pokazano; denaturacja, konwersja wodorosiarczynu, amplifikacja i analiza PCR. W prawym panelu przedstawiono modyfikacje cząsteczki cytozyny, które zachodzą podczas konwersji wodorosiarczynu.

Rysunek 3. Optymalizacja amplifikacji PCR. A. Elektroforeza w żelu agarozowym z profilem amplifikacji PCR w gradiencie temperatury z mieszaniny 50% metylowanego i niemetylowanego DNA. Fragmenty zostały strawione za pomocą Taq1 (T) lub HpaIII (H), które trawią odpowiednio metylowany DNA i niesiarczynowy DNA. B. Analiza krzywej dysocjacji cieplnej wykazuje równą proporcję metylowanego i niemetylowanego DNA (czerwona linia 50/50 mieszanki) w porównaniu z kontrolną amplifikacją w pełni metylowanego (różowa linia, M) i niemetylowanego DNA (zielona linia, U), które dysocjują odpowiednio w temperaturze 82,1 °C i 78,9 °C.

Rysunek 4. Przykład sekwencjonowania bezpośredniego i mapy wodorosiarczynowej. A. Ślad sekwencji z trzech różnych linii komórkowych z miejscami CpG zaznaczonymi na żółto. Linia komórkowa X wykazuje 100% metylację we wszystkich trzech miejscach CpG, podczas gdy linie komórkowe Y i Z wykazują różne stopnie metylacji, co widać po nakładających się sygnałach G / A. B. Reprezentatywna mapa wodorosiarczynowa przedstawiająca gęstość metylacji (czerwone kropki) w poszczególnych miejscach CpG, oznaczoną przez bezpośrednie sekwencjonowanie poszczególnych klonów.

Rysunek 5. Wysokoprzepustowa analiza metylacji DNA przy użyciu Sequenom. A. Widok widma przy użyciu technologii Sequenom epiTYPER. Fragmenty DNA wykazują specyficzne widma, w zależności od ilości obecnej metylacji DNA. B. Epigram podsumowujący procentową zawartość metylacji DNA w każdym miejscu CpG dla czterech różnych linii komórkowych. C. Podsumowanie wykresu metylacji pochodzące z Epigramu Sequenom.

Discussion

Analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania genomowego DNA przekształconego w wodorosiarczyn jest dobrze ugruntowaną i wszechstronną metodą, która ułatwia identyfikację i kwantyfikację metylacji DNA w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu. Jednak konwersja wodorosiarczynu i późniejsza analiza opiera się na założeniu, że DNA zostało w pełni przekształcone, przy czym każda niemetylowana cytozyna została zdeaminowana do uracylu, a tylko metylowane cytozyny pozostały niereaktywne. Jeśli konwersja jest niekompletna, mogą pojawić się problemy z analizą, ponieważ nieprzekształcone niemetylowane cytozyny mogą być błędnie interpretowane jako cytozyny metylowane. Konwersja wodorosiarczynu może być optymalizowana na różnych etapach, aby zmaksymalizować procent konwersji. Aby DNA mogło zostać w pełni przekształcone, najpierw musi być jednoniciowe, tak aby reszty cytozyny były wystawione na działanie jonów wodorosiarczynowych. Pierwszy krok, denaturacja DNA, jest krytyczny i może być źródłem niepełnej konwersji, jeśli DNA nie jest w pełni zdenaturowane. Aby zapewnić, że DNA jest w pełni zdenaturowane, ważne jest, aby parametry reakcji, w tym usunięcie wszystkich powiązanych białek, odpowiednie stężenie soli, temperatura i czas inkubacji, były odpowiednie do utrzymania DNA w konformacji jednoniciowej. Ważne jest, aby używać świeżego 3M NaOH i zapewnić odpowiedni czas inkubacji. Jeśli DNA jest odporne na denaturację, niektóre modyfikacje protokołu, w tym wydłużenie czasu inkubacji do 30 minut lub fragmentacja DNA przed denaturacją, mogą ułatwić denaturację DNA. Ponadto jednoniciowy DNA (ssDNA) może ponownie wyżarzać się do dwuniciowego DNA (dsDNA) podczas reakcji konwersji wodorosiarczynu. Przeprowadzanie reakcji w wyższej temperaturze (90-95°C) okresowo lub w sposób ciągły podczas reakcji wodorosiarczynowej może pomóc w utrzymaniu ssDNA. Jednak ważne jest, aby mieć świadomość, że degradacja DNA jest znacznie przyspieszona w tych wyższych temperaturach. Można również dodać różne odczynniki, aby zakłócić ponowne wyżarzanie nici DNA, takie jak mocznik.

Stężenie DNA i jego jakość mogą również wpływać na skuteczność reakcji wodorosiarczynowej i ostateczną wydajność PCR. Degradacja DNA jest ograniczeniem protokołu konwersji wodorosiarczynu. Chemiczna obróbka DNA wprowadza różne pęknięcia nici w ssDNA i niektóre trudne warunki niezbędne do całkowitej konwersji wodorosiarczynu, w tym wysokie stężenie wodorosiarczynu, długi czas inkubacji, mogą przyspieszyć degradację DNA. W opisanych standardowych warunkach reakcji degradacja DNA nie jest powszechnym problemem, jednak jeśli zostaną wprowadzone modyfikacje protokołu, na przykład w przypadku sekwencji opornych na konwersję, w przypadku matryc DNA, które są zdegradowane lub złej jakości, takich jak próbki FFPE, degradacja DNA może stać się znaczącym ograniczeniem.

Próbki DNA utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie (FFPE) i zdegradowane mogą być skutecznie przekształcane i amplifikowane wodorosiarczynem przy użyciu tego protokołu, jednak zaleca się modyfikacje w celu zapewnienia, że DNA nie ulega dalszej degradacji. Zaleca się stosowanie nośnego RNA, takiego jak tRNA. Również glikogen może być dodawany jako nośnik, gdy stężenie DNA jest niskie (<200 ng). Ponieważ DNA wyizolowane z tkanek FFPE jest już rozdrobnione, a dalsza fragmentacja zachodzi podczas deaminacji, należy zachować ostrożność w celu zminimalizowania dalszej degradacji. Nie należy dalej fragmentować DNA przed denaturacją i ograniczyć czas inkubacji reakcji wodorosiarczynowej do 4 godzin. Projektuj amplikony nie większe niż 300 pz ze względu na fragmentację DNA.

Innym czynnikiem, który może wpływać na amplifikację PCR, jest konwersja wodorosiarczynów niemetylowanych cytozyn, zmniejszająca złożoność matrycy DNA. Następujący protokół projektowania startera opisany w sekcji 4.1, zwiększona długość startera i zagnieżdżony PCR mogą pomóc w zwiększeniu swoistości i wydajności PCR.

Wreszcie, ponieważ matryca DNA jest zmieniana podczas konwersji wodorosiarczynu, błąd amplifikacji może być problemem. Upewnij się, że proporcjonalna amplifikacja PCR metylowanych i niemetylowanych matryc jest sprawdzana za pomocą kontrolnej mieszanki DNA 50/50 M/U, jak opisano w protokole, patrz rysunek 3. Upewnij się również, że amplifikacja tylko przekształconych matryc odbywa się za pomocą enzymu restrykcyjnego HpaIII i elektroforezy żelowej (ryc. 3). Warunki PCR mogą wymagać optymalizacji poprzez zmianę temperatury i/lub stężenia magnezu lub wydłużenie czasu przedłużenia. Niektóre szablony wydają się być szczególnie problematyczne i może być konieczne dostosowanie pozycji startera lub użycie zdegenerowanych starterów.

Techniki sekwencjonowania nowej generacji szybko ewoluują, aby osiągnąć rozdzielczość podobną do sekwencjonowania genomu wodorosiarczynowego, a sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek trzeciej generacji ma potencjał, aby umożliwić analizę zarówno pierwotnego DNA, jak i metylacji bez konieczności sekwencjonowania wodorosiarczynów. Jednak powszechna dostępność i specyfika tych technik są jeszcze odległe o pewną przyszłość. Sekwencjonowanie genomu wodorosiarczynowego jest złotym standardem w analizie metylacji i jest solidnym protokołem. Metoda rozwinęła się do punktu, w którym powszechne problemy i ograniczenia zostały rozwiązane, a zastosowania rozszerzyły się z indywidualnych analiz genów na wysokoprzepustową i pełną analizę genomu opisaną przez Clarka i wsp. 2006⁴. Wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów i dodatkowe zalecenia przedstawiono w tabeli 1. Sugeruje się, że optymalnym podejściem jest początkowe postępowanie zgodnie ze standardowym protokołem i wprowadzanie modyfikacji tylko wtedy, gdy pojawi się problem.

Tabela 1. Wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nazwa materiału Typ	Pirosiarczyn
sodu	Ajax Finechem
Hydrochinon	Merck & Co., Inc.
Czarodziejski system oczyszczania DNA	Promega Corp.