Metylacja DNA: modyfikacja i analiza pirosiarczynowa

Podsumowanie

Złotym standardem analizy metylacji DNA jest sekwencjonowanie genomowe DNA poddanego konwersji pirosiarczynowej. Metoda ta wykorzystuje zwiększoną wrażliwość cytozyny w porównaniu z 5-metylocytozyną (5-MeC) na deaminację pirosiarczynową w warunkach kwasowych. Niezmetylowane cytozyny można odróżnić od cytozyn zmetylowanych po amplifikacji PCR docelowego DNA genomowego.

Streszczenie

Epigenetyka opisuje dziedziczne zmiany w funkcji genów, które zachodzą niezależnie od sekwencji DNA. Molekularne podstawy epigenetycznej regulacji genów są złożone i polegają w istocie na modyfikacjach samego DNA lub białek, z którymi DNA tworzy kompleksy. Przeważającą modyfikacją epigenetyczną DNA w genomach ssaków jest metylacja nukleotydów cytozyny (5-MeC). Metylacja DNA dostarcza informacji dla mechanizmu ekspresji genów na temat tego, gdzie i kiedy gen powinien zostać wyeksponowany. Główną sekwencją docelową dla metylacji DNA u ssaków są dinukleotydy 5'-CpG-3' (Rycina 1). Dinukleotydy CpG nie są rozmieszczone równomiernie w całym genomie, lecz koncentrują się w regionach powtarzalnych sekwencji genomowych oraz w tzw. „wyspach” CpG, które są powszechnie powiązane z promotorami genów (Rycina 1). Wzorce metylacji DNA są ustalane wczesnym etapie rozwoju, modyfikowane podczas różnicowania tkankowego i zaburzone w wielu stanach chorobowych, w tym w nowotworach. Aby zrozumieć biologiczną rolę metylacji DNA oraz jej znaczenie w chorobach ludzi, wymagane są precyzyjne, wydajne i powtarzalne metody wykrywania i ilościowego oznaczania poszczególnych 5-MeC.

Niniejszy protokół konwersji pirosiarczynowej stanowi „złoty standard” w analizie metylacji DNA i umożliwia identyfikację oraz kwantyfikację metylacji DNA z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu. Chemizm deaminacji cytozyny za pomocą pirosiarczynu sodu obejmuje trzy etapy (Rysunek 2). (1) Sulfonowanie: przyłączenie pirosiarczynu do wiązania podwójnego 5-6 cytozyny; (2) deaminacja hydrolityczna: hydrolityczna deaminacja powstałej pochodnej cytozyna-pirosiarczyn, co prowadzi do powstania pochodnej uracyl-pirosiarczyn; (3) desulfonowanie alkaliczne: usunięcie grupy sulfonowej poprzez traktowanie zasadą, w wyniku czego powstaje uracyl. Pirosiarczyn preferencyjnie deaminuje cytozynę do uracylu w jednoniciowym DNA, podczas gdy 5-MeC jest odporne na deaminację indukowaną pirosiarczynem. Podczas amplifikacji PCR uracyl jest amplifikowany jako tymina, natomiast reszty 5-MeC pozostają jako cytozyny, co pozwala na odróżnienie zmetylowanych CpG od niezmetylowanych CpG na podstawie obecności reszty cytozyny „C” w przeciwieństwie do reszty tyminy „T” podczas sekwencjonowania.

Modyfikacja DNA poprzez konwersję pirosiarczynową jest uznanym protokołem, który można wykorzystać w wielu metodach analizy metylacji DNA. Od czasu, gdy detekcja 5-MeC za pomocą konwersji pirosiarczynowej została po raz pierwszy wykazana przez Frommera et al.¹ oraz Clark et al.², metody oparte na konwersji pirosiarczynowej DNA genomowego stanowią większość nowych danych na temat metylacji DNA. W zależności od wymaganego stopnia specyficzności i rozdzielczości metylacji można stosować różne metody analizy po PCR. Klonowanie i sekwencjonowanie to wciąż najłatwiej dostępna metoda, która pozwala na uzyskanie rozdzielczości na poziomie pojedynczego nukleotydu dla metylacji w obrębie cząsteczki DNA.

Protokół

Protokół konwersji pirosiarczynowej

Poniżej opisano standardowy protokół konwersji 2 μg DNA genomowego. Pomyślnie przeprowadzić można również obróbkę siarczanem bisulfitem mniejszych lub większych ilości DNA genomowego (100 pg-200 μg). Te warunki reakcji prowadzą do całkowitej konwersji (99,5-99,7%) niemal każdej docelowej sekwencji DNA³.

1. Przygotowanie DNA

Przygotować próbki, inkubując DNA genomiczne w buforze do lizy DNA z bisulfitami (2 μg tRNA, 280 ng/μl Proteinaza K, 1% SDS) w całkowitej objętości 18 μl przez 1 hr w temperaturze 37°C. Uwaga: Jest to istotne dla osiągnięcia maksymalnej konwersji bisulfitowej, zwłaszcza w przypadku DNA izolowanego z próbek klinicznych, w których z DNA mogą wciąż być związane białka.

2. Denaturacja DNA

1. Zdenaturuj 2 μg DNA w objętości 20 μl, dodając 2 μl świeżo przygotowanego 3M NaOH do stężenia końcowego 0.3M.
2. Inkubuj próbki w kąpieli wodnej w temperaturze 37°C przez 15 min, a następnie w bloku grzewczym w temperaturze 90°C przez 2 min. Natychmiast umieść probówki na lodzie na 5 min.
3. Wirowarkuj probówki w temperaturze 4°C przez 10 s przy 10,000 g, aby upewnić się, że DNA znajduje się na dnie probówki.

3. Deaminacja pirosiarczynowa

Sulfonowanie i deaminacja hydrolityczna

1. Przygotować świeże roztwory 10 mM chinolu oraz nasyconego pirosiarczynu sodu o pH 5,0 (7,6 g Na₂S₂O₅ z 464 μl 10 M NaOH, dopełnione wodą do 15 ml). Roztwór nasyconego pirosiarczynu uzyskuje się poprzez delikatne odwracanie mieszaniny odczynnika z H₂O, przy minimalnym mieszaniu i napowietrzaniu. W razie potrzeby skorygować pH za pomocą 10 M NaOH, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie pirosiarczynu. Uwaga: Ponieważ jest to roztwór nasycony, mogą pozostać niewielkie nierozpuszczone grudki.
2. Do zdenaturowanego DNA (20 μl) dodać 208 μl nasyconego pirosiarczynu oraz 12 μl 10 mM chinolu, tak aby końcowa objętość wyniosła 240 μl, a końcowe stężenia 2,31 M pirosiarczynu i 0,5 mM chinolu przy pH 5,0. Delikatnie wymieszać wszystkie odczynniki i odwirować przez 10 s, aby wszystkie kropelki znalazły się na dnie probówki.
3. Przykryć próbki 200 μl oleju mineralnego. Inkubować próbki w kąpieli wodnej w temperaturze 55°C przez 4–16 h. Czas traktowania pirosiarczynem zależy od ilości i jakości DNA przeznaczonego do konwersji. W przypadku DNA słabej jakości lub zdegradowanego ograniczyć czas inkubacji do 4 h. Uwaga: Ważne jest, aby konwersja pirosiarczynowa odbywała się w ciemności w celu uniknięcia utleniania; jeśli nie jest to możliwe, przed inkubacją owinąć probówki folią.
4. Po odpowiednim czasie inkubacji krótko wirować probówki w mikrocentry fudze, aby upewnić się, że cały płyn znajduje się na dnie probówki.
5. Odzyskać DNA traktowane pirosiarczynem spod warstwy oleju, ostrożnie pipetując roztwór DNA z dna probówki, unikając pobrania oleju mineralnego.

Odsalanie

5. Usuń wszelkie wolne jony pirosiarczynu, przepuszczając próbkę przez kolumnę odsalającą i elując ją w 50 μl wody milli-Q (MQH₂O). W zależności od ilości i jakości DNA genomowego oraz sposobu jego przygotowania, można zastosować różne kolumny odsalające. W naszej rutynie stosujemy kolumny Promega Wizard Clean up, ponieważ nadają się one do usuwania SDS użytego podczas przygotowania DNA przed konwersją.

Alkaliczna desulfonacja

6. Addukt pirosiarczynowy jest usuwany z pierścienia uracylu poprzez desulfonację. Przeprowadź desulfonację, dodając 5,5 μl świeżo przygotowanego 3M NaOH do stężenia końcowego 0,3M, a następnie inkubuj próbki w temperaturze 37°C przez 15 min.
7. Krótko odwiruj w wirówce i dodaj 1 μl tRNA (10 mg/ml).
8. Zneutralizuj roztwór poprzez dodanie 33 μl octanu amonu (NH₄O Ac), pH 7,0 do stężenia końcowego 3M.
9. Wyprecypituj DNA etanolem, dodając 330 μl lodowatego 100% etanolu, i dokładnie wymieszaj przez odwracanie probówki. Pozostaw w temperaturze -20μC na 1 h lub przez noc. Wiruj przy 14 000 g przez 15 min w temperaturze 4°C. Usuń wszystkie ślady supernatantu i wysusz osad DNA przez około 20 min.
10. Resuspenduj osad DNA w 50 μl/μg 0,1 TE (10mM Tris-HCL, 0,1mM EDTA, pH 8,0) lub H₂O. Pozostaw w temperaturze pokojowej przez około 2 h. Okresowo mieszaj próbki w wirówce typu vortex, aby upewnić się, że DNA zostało rozpuszczone, a następnie krótko odwiruj.
11. Wykorzystaj natychmiast do amplifikacji PCR lub przechowuj w temperaturze -20°C przez okres od 1 do 10 lat, w zależności od ilości i jakości DNA.

4. Amplifikacja PCR

Projektowanie starterów

1. Skuteczne zaprojektowanie starterów specyficznych dla konwersji bisulfitowej w PCR jest kluczowe dla zapewnienia wydajnej i nieobciążonej amplifikacji całkowicie przekonwertowanego DNA. W celu ułatwienia projektowania starterów stosuje się następujące wytyczne.

Wytyczne dotyczące projektowania starterów

Termocyklowanie

2. Aby przetestować proporcjonalną amplifikację PCR DNA zmetylowanego i niezmetylowanego, należy użyć kontrolnej próbki w stosunku 50:50 (DNA zmetylowany/niezmetylowany) w pełni poddanej konwersji pirosiarczynowej i przeprowadzić amplifikację z użyciem starterów specyficznych dla konwersji pirosiarczynowej w zoptymalizowanych warunkach reakcji PCR (Rysunek 3). W przypadku kontroli 50:50 (zmetylowany:niezmetylowany) należy zastosować DNA zmetylowane in vitro za pomocą SssI oraz DNA amplifikowane metodą WGA (whole genome amplification) lub DNA z krwi pełnej. Należy pamiętać, że niektóre geny są naturalnie zmetylowane w krwi, dlatego w takich przypadkach najlepiej użyć DNA WGA jako kontroli „niezmetylowanej”.
3. Przygotować mieszaniny reakcyjne do amplifikacji PCR w aliquotach 100 μl zawierających 2 μl genomicznego DNA poddanego konwersji pirosiarczynowej, 200 μM dNTP, 1 μM starterów, 1.5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10mM Tris-HCL, pH 8.3 oraz 0.15 μl polimerazy Taq.
4. W termocyklerze z gradientem temperatury ustawić reakcję w gradiencie +/- 3°C od przewidywanej Tm startera w 10 probówkach.

5. Aby sprawdzić, czy amplikony zmetylowane i niezmetylowane zostały namnożone proporcjonalnie, można poddać amplikon trawieniu za pomocą odpowiedniego enzymu restrykcyjnego, takiego jak Taq 1 (TCGA), który trawi zmetylowane DNA, ale nie trawi DNA niezmetylowanego w przypadku zmiany miejsca rozpoznawania enzymu na TTGA po konwersji bisulfitowej. Stopień trawienia można zwizualizować za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (Rycina 3A). Alternatywnie, do reakcji PCR można dodać SYBRGreen (0,2 μl rozcieńczenia 1:1000), a stopień metylacji ocenić, wykonując wykresy dysocjacji termicznej w termocyklerze do real-time PCR (Rycina 3B).
6. Mieszaninę reakcyjną PCR, w tym stężenie MgCl₂, oraz warunki termocyklowania może być konieczne dostosować w celu zwiększenia wydajności PCR lub zapewnienia proporcjonalnej amplifikacji PCR fragmentów zmetylowanych i niezmetylowanych.
7. Po optymalizacji warunków PCR można przeprowadzić amplifikację PCR próbek poddanych konwersji bisulfitowej. Uwaga: Po optymalizacji Tm nie ma konieczności stosowania PCR z gradientem temperatury.

5. Reprezentatywne wyniki:

Przykład optymalizacji amplifikacji PCR po konwersji bisulfitowej przedstawiono na rysunku 3. Optymalne warunki amplifikacji PCR powinny pozwalać na amplifikację amplikonów zmetylowanych i niezmetylowanych proporcjonalnie i bez stronniczości. Rysunek 3A przedstawia żel agarozowy z profilem amplifikacji PCR w gradiencie temperatury dla mieszaniny 50% DNA zmetylowanego i niezmetylowanego. Amplikony PCR poddano działaniu enzymu restrykcyjnego Taq 1 (TCGA), który trawi zmetylowane (M) DNA, lecz nie trawi DNA niezmetylowanego (U), ponieważ miejsce rozpoznawania enzymu restrykcyjnego zostaje zmienione w wyniku konwersji bisulfitowej na TTGA. Jeśli DNA zmetylowane i niezmetylowane są amplifikowane proporcjonalnie, oczekiwana jest równa ilość produktu PCR pociętego i niepociętego. Na tym żelu widać, że optymalne warunki termocyklingu dla amplifikacji bez stronniczości występują przy 56.1°C (T). Pełną konwersję DNA bisulfitowego można również przeanalizować poprzez trawienie enzymem specyficznym dla miejsca cytozyny, takim jak HpaIII (CCGG). HpaIII trawi DNA tylko wtedy, gdy konwersja nie powiodła się, ponieważ miejsce restrykcyjne zostaje zachowane. Jeśli konwersja jest pełna, miejsce restrykcyjne zostanie przekształcone w TCGG lub TTGG, w zależności od stanu metylacji DNA. Pełną konwersję bisulfitową DNA można zobaczyć na rysunku 3A (H).

Rysunek 3B przedstawia wykres dysocjacji w czasie rzeczywistym, który może służyć również jako narzędzie do określenia, czy występuje błąd amplifikacji w zależności od temperatury, w której dysocjują poszczególne cząsteczki. Na tym rysunku widać, że PCR przeprowadziła amplifikację DNA zmetylowanego (M) i niezmetylowanego (U) proporcjonalnie z mieszaniny składającej się w 50% z DNA zmetylowanego i niezmetylowanego, w porównaniu z amplifikacją kontrolną w pełni zmetylowanego i niezmetylowanego DNA, które dysocjują odpowiednio w 82.1μC i 78.9μC.

Po optymalizacji warunków termocyklingu i reakcji, próbki poddane działaniu pirosiarczynu można powielić za pomocą starterów specyficznych dla nici i pirosiarczynu w pojedynczej lub półgniazdowej reakcji PCR. Powstałe fragmenty PCR można zwizualizować za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i zsekwencjonować bezpośrednio (Rycina 4A) lub poprzez klonowanie i sekwencjonowanie. Po klonowaniu i sekwencjonowaniu stan metylacji poszczególnych cząsteczek można zestawić w formie mapy pirosiarczynowej (Rycina 4B), aby zwizualizować heterogeniczność metylacji.

Wysokoprzepustowa ilościowa analiza metylacji może być przeprowadzona z wykorzystaniem technologii stosowanej w metodzie Sequenom EpiTYPER. W tej metodzie DNA poddane konwersji pirosiarczynowej jest powielane za pomocą specyficznych dla konwersji pirosiarczynowej starterów PCR, a następnie poddawane zastrzeżonemu procesowi cięcia. Powstałe fragmenty są analizowane ilościowo za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF, przy czym uzyskane widmo zależy od obecności zmetylowanych cytozyn (Rysunek 5A). Podsumowanie stopni metylacji w próbce może być następnie przedstawione w formie Epigramu (Rysunek 5B) lub wykresu metylacji (Rysunek 5C).

Rycina 1. Schemat zmetylowanych CpG. W normalnej komórce wyspy CpG związane z promotorem są w przeważającej mierze niezmetylowane (szare), podczas gdy miejsca CpG w obrębie ciał genów występują rzadko i są zazwyczaj zmetylowane (czerwone). Panel po prawej stronie powiększa strukturę molekularną DNA w pojedynczym miejscu CpG i pokazuje metylację z cząsteczką CH3 przy węglu 5 cytozyny.

Rycina 2. Schemat konwersji chemicznej. Analiza metylacji DNA obejmuje cztery główne etapy, jak pokazano na schemacie: denaturację, konwersję pirosiarczynową, amplifikację PCR oraz analizę. Na prawym panelu przedstawiono modyfikacje cząsteczki cytozyny zachodzące podczas konwersji pirosiarczynowej.

Rycina 3. Optymalizacja amplifikacji PCR. A. Elektroforeza w żelu agarozowym z profilem amplifikacji PCR w gradiencie temperatury dla mieszaniny 50% zmetylowanego i niezmetylowanego DNA. Fragmenty zostały poddane trawieniu enzymem Taq1 (T) lub HpaIII (H), które trawią odpowiednio zmetylowane DNA oraz DNA niepoddane konwersji bisulfitowej. B. Analiza krzywej dysocjacji termicznej wykazuje równą proporcję zmetylowanego i niezmetylowanego DNA (czerwona linia, mieszanina 50/50) w porównaniu do amplifikacji kontrolnej w pełni zmetylowanego (różowa linia, M) i niezmetylowanego DNA (zielona linia, U), które dysocjują odpowiednio w 82,1°C i 78,9°C.

Rysunek 4. Przykład sekwencjonowania bezpośredniego i mapy bisulfitowej. A. Chromatogramy sekwencyjne z trzech różnych linii komórkowych z zaznaczonymi na żółto miejscami CpG. Linia komórkowa X wykazuje 100% metylacji we wszystkich trzech miejscach CpG, podczas gdy linie komórkowe Y i Z wykazują różny stopień metylacji, co objawia się nakładaniem się sygnałów G/A. B. Reprezentatywna mapa bisulfitowa przedstawiająca gęstość metylacji (czerwone kropki) w poszczególnych miejscach CpG, wyznaczona na podstawie bezpośredniego sekwencjonowania pojedynczych klonów.

Rysunek 5. Wysokoprzepustowa analiza metylacji DNA z użyciem systemu Sequenom. A. Widok widma z wykorzystaniem technologii Sequenom epiTYPER. Fragmenty DNA wykazują specyficzne widma w zależności od stopnia metylacji DNA. B. Podsumowanie epigramu przedstawiające procent metylacji DNA w każdym miejscu CpG dla czterech różnych linii komórkowych. C. Podsumowanie wykresu metylacji wygenerowane z epigramu Sequenom.

Dyskusja

Analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania genomicznego DNA poddanego konwersji pirosiarczynowej jest uznaną i wszechstronną metodą, która umożliwia identyfikację i kwantyfikację metylacji DNA z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu. Konwersja pirosiarczynowa i późniejsza analiza opierają się jednak na założeniu, że DNA zostało w pełni przekonwertowane, tak aby każda niemetylowana cytozyna została deaminowana do uracylu, a jedynie cytozyny zmetylowane pozostały nie reaktywne. W przypadku niepełnej konwersji mogą pojawić się problemy z analizą, ponieważ nieprzekonwertowane cytozyny niemetylowane mogą zostać błędnie zinterpretowane jako cytozyny zmetylowane. Konwersję pirosiarczynową można optymalizować na różnych etapach, aby zmaksymalizować procent konwersji. Aby DNA mogło zostać w pełni przekonwertowane, musi być najpierw jednoniciowe, tak aby pozostałości cytozyny były wystawione na działanie jonów pirosiarczynu. Pierwszy krok, denaturacja DNA, jest krytyczny i może być przyczyną niepełnej konwersji, jeśli DNA nie zostanie całkowicie zdenaturowane. Aby zapewnić pełną denaturację DNA, ważne jest, aby parametry reakcji, w tym usunięcie wszystkich powiązanych białek, odpowiednie stężenie soli, temperatura i czas inkubacji, były właściwe dla utrzymania DNA w konformacji jednoniciowej. Ważne jest stosowanie świeżego 3M NaOH oraz zapewnienie odpowiedniego czasu inkubacji. Jeśli DNA wykazuje oporność na denaturację, niektóre modyfikacje protokołu, w tym wydłużenie czasu inkubacji do 30 minut lub fragmentacja DNA przed denaturacją, mogą ułatwić ten proces. Ponadto jednoniciowe DNA (ssDNA) może ponownie ulec hybrydyzacji do dwuniciowego DNA (dsDNA) podczas reakcji konwersji pirosiarczynowej. Prowadzenie reakcji w wyższej temperaturze (90-95°C), okresowo lub w sposób ciągły podczas reakcji pirosiarczynowej, może pomóc w utrzymaniu formy ssDNA. Należy jednak mieć na uwadze, że degradacja DNA jest znacznie przyspieszona w tych wyższych temperaturach. W celu zahamowania ponownej hybrydyzacji nici DNA można dodać różne odczynniki, takie jak mocznik.

Stężenie DNA oraz jego jakość mogą również wpływać na wydajność reakcji z bisulfitem i ostateczną wydajność PCR. Degradacja DNA stanowi ograniczenie protokołu konwersji bisulfitem. Obróbka chemiczna DNA powoduje liczne pęknięcia nici w ssDNA, a niektóre z rygorystycznych warunków niezbędnych do pełnej konwersji bisulfitem, w tym wysokie stężenie bisulfitu i długi czas inkubacji, mogą przyspieszać degradację DNA. W opisanych standardowych warunkach reakcji degradacja DNA nie jest powszechnym problemem, jednakże w przypadku wprowadzenia modyfikacji protokołu, na przykład dla sekwencji opornych na konwersję lub dla matryc DNA zdegradowanych lub słabej jakości, takich jak próbki FFPE, degradacja DNA może stać się istotnym ograniczeniem.

Próbki DNA utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie (FFPE) oraz próbki DNA zdegradowanego można skutecznie poddać konwersji pirosiarczynowej i amplifikacji zgodnie z niniejszym protokołem, jednak zaleca się wprowadzenie modyfikacji w celu zapobieżenia dalszej degradacji DNA. Rekomenduje się zastosowanie RNA nośnikowego, takiego jak tRNA. W przypadku niskiego stężenia DNA (<200 ng) jako nośnik można dodać glikogen. Ponieważ DNA izolowane z tkanek FFPE jest już pofragmentowane, a dalsza fragmentacja następuje podczas deaminacji, należy zachować ostrożność, aby zminimalizować dalszą degradację. Nie należy dodatkowo fragmentować DNA przed denaturacją, a czas inkubacji w reakcji pirosiarczynowej należy ograniczyć do 4 godzin. Ze względu na pofragmentowanie DNA, amplikony nie powinny przekraczać 300 bp.

Kolejnym czynnikiem, który może wpływać na amplifikację PCR, jest konwersja niezmetylowanych cytozyn za pomocą pirosiarczynu, która zmniejsza złożoność matrycy DNA. Opisany w sekcji 4.1 protokół projektowania starterów, zwiększenie długości starterów oraz nested PCR mogą pomóc w zwiększeniu swoistości i wydajności PCR.

Na koniec, ponieważ matryca DNA ulega zmianie podczas konwersji pirosiarczynowej, problemem może być błąd amplifikacji. Należy upewnić się, że proporcjonalna amplifikacja PCR matryc zmetylowanych i niezmetylowanych została sprawdzona za pomocą kontrolnej mieszaniny DNA M/U w stosunku 50/50, zgodnie z opisem w protokole (patrz Rysunek 3). Należy również potwierdzić za pomocą enzymu restrykcyjnego HpaIII i elektroforezy żelowej, że amplifikacja zachodzi wyłącznie w przypadku matryc poddanych konwersji (Rysunek 3). Warunki PCR mogą wymagać optymalizacji poprzez zmianę temperatury i/lub stężenia magnezu lub wydłużenie czasu elongacji. Niektóre matryce mogą być szczególnie problematyczne, co może wymagać skorygowania pozycji starterów lub zastosowania starterów degenerowanych.

Techniki sekwencjonowania następnej generacji ewoluują w szybkim tempie, aby osiągnąć rozdzielczość zbliżoną do sekwencjonowania genomowego z użyciem pirosiarczynu, a sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek trzeciej generacji ma potencjał, który pozwoli na analizę zarówno pierwotnego DNA, jak i metylacji bez konieczności sekwencjonowania pirosiarczynowego. Jednakże powszechna dostępność i specyficzność tych technik pozostają wciąż kwestią przyszłości. Sekwencjonowanie genomowe z użyciem pirosiarczynu jest złotym standardem w analizie metylacji i stanowi solidny protokół. Metoda ta rozwinęła się do stopnia, w którym typowe problemy i ograniczenia zostały rozwiązane, a zastosowania rozszerzyły się z analiz pojedynczych genów na analizy wysokoprzepustowe i całogenomowe opisane przez Clark et al. 2006⁴. Wytyczne dotyczące rozwiązywania problemów oraz dodatkowe zalecenia przedstawiono w Tabeli 1. Sugeruje się, aby optymalnym podejściem było początkowe stosowanie standardowego protokołu i wprowadzanie modyfikacji jedynie w przypadku wystąpienia problemów.

Tabela 1. Wytyczne dotyczące rozwiązywania problemów

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nazwa materiału	Typ
Pirosiarczyn sodu	Ajax Finechem
Hydrochinon	Merck & Co., Inc.
Zestaw do oczyszczania DNA Wizard	Promega Corp.