Metylacja DNA: modyfikacja i analiza pirosiarczynowa

Podsumowanie

Złotym standardem analizy metylacji DNA jest sekwencjonowanie genomowe DNA poddanego konwersji pirosiarczynowej. Metoda ta wykorzystuje zwiększoną wrażliwość cytozyny w porównaniu z 5-metylocytozyną (5-MeC) na deaminację pirosiarczynową w warunkach kwasowych. Niezmetylowane cytozyny można odróżnić od cytozyn zmetylowanych po amplifikacji PCR docelowego DNA genomowego.

Streszczenie

Epigenetyka opisuje dziedziczne zmiany w funkcji genów, które zachodzą niezależnie od sekwencji DNA. Molekularne podstawy epigenetycznej regulacji genów są złożone i polegają w istocie na modyfikacjach samego DNA lub białek, z którymi DNA tworzy kompleksy. Przeważającą modyfikacją epigenetyczną DNA w genomach ssaków jest metylacja nukleotydów cytozyny (5-MeC). Metylacja DNA dostarcza informacji dla mechanizmu ekspresji genów na temat tego, gdzie i kiedy gen powinien zostać wyeksponowany. Główną sekwencją docelową dla metylacji DNA u ssaków są dinukleotydy 5'-CpG-3' (Rycina 1). Dinukleotydy CpG nie są rozmieszczone równomiernie w całym genomie, lecz koncentrują się w regionach powtarzalnych sekwencji genomowych oraz w tzw. „wyspach” CpG, które są powszechnie powiązane z promotorami genów (Rycina 1). Wzorce metylacji DNA są ustalane wczesnym etapie rozwoju, modyfikowane podczas różnicowania tkankowego i zaburzone w wielu stanach chorobowych, w tym w nowotworach. Aby zrozumieć biologiczną rolę metylacji DNA oraz jej znaczenie w chorobach ludzi, wymagane są precyzyjne, wydajne i powtarzalne metody wykrywania i ilościowego oznaczania poszczególnych 5-MeC.

Niniejszy protokół konwersji pirosiarczynowej stanowi „złoty standard” w analizie metylacji DNA i umożliwia identyfikację oraz kwantyfikację metylacji DNA z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu. Chemizm deaminacji cytozyny za pomocą pirosiarczynu sodu obejmuje trzy etapy (Rysunek 2). (1) Sulfonowanie: przyłączenie pirosiarczynu do wiązania podwójnego 5-6 cytozyny; (2) deaminacja hydrolityczna: hydrolityczna deaminacja powstałej pochodnej cytozyna-pirosiarczyn, co prowadzi do powstania pochodnej uracyl-pirosiarczyn; (3) desulfonowanie alkaliczne: usunięcie grupy sulfonowej poprzez traktowanie zasadą, w wyniku czego powstaje uracyl. Pirosiarczyn preferencyjnie deaminuje cytozynę do uracylu w jednoniciowym DNA, podczas gdy 5-MeC jest odporne na deaminację indukowaną pirosiarczynem. Podczas amplifikacji PCR uracyl jest amplifikowany jako tymina, natomiast reszty 5-MeC pozostają jako cytozyny, co pozwala na odróżnienie zmetylowanych CpG od niezmetylowanych CpG na podstawie obecności reszty cytozyny „C” w przeciwieństwie do reszty tyminy „T” podczas sekwencjonowania.

Modyfikacja DNA poprzez konwersję pirosiarczynową jest uznanym protokołem, który można wykorzystać w wielu metodach analizy metylacji DNA. Od czasu, gdy detekcja 5-MeC za pomocą konwersji pirosiarczynowej została po raz pierwszy wykazana przez Frommera et al.¹ oraz Clark et al.², metody oparte na konwersji pirosiarczynowej DNA genomowego stanowią większość nowych danych na temat metylacji DNA. W zależności od wymaganego stopnia specyficzności i rozdzielczości metylacji można stosować różne metody analizy po PCR. Klonowanie i sekwencjonowanie to wciąż najłatwiej dostępna metoda, która pozwala na uzyskanie rozdzielczości na poziomie pojedynczego nukleotydu dla metylacji w obrębie cząsteczki DNA.

Protokół

Protokół konwersji pirosiarczynowej

Poniżej opisano standardowy protokół konwersji 2 μg genomowego DNA. Zabieg bisulfitowy można z powodzeniem przeprowadzić również dla mniejszych lub większych ilości genomowego DNA (100 pg-200 μg). Te warunki reakcji zapewniają pełną konwersję (99,5-99,7%) niemal każdej docelowej sekwencji DNA³.

1. Przygotowanie DNA

Przygotuj próbki, inkubując genomowe DNA w buforze do lizy DNA z bisulfitem (2 μg tRNA, 280 ng/μl Proteinaza K, 1% SDS) w całkowitej objętości 18 μl przez 1 hr w 37°C. Uwaga: Jest to istotne dla osiągnięcia maksymalnej konwersji bisulfitowej, szczególnie w przypadku DNA izolowanego z próbek klinicznych, gdzie wciąż mogą występować białka związane z DNA.

2. Denaturacja DNA

1. Zdenaturuj 2 μg DNA w objętości 20 μl, dodając 2 μl świeżo przygotowanego 3M NaOH do uzyskania stężenia końcowego 0,3M.
2. Inkubuj próbki w kąpieli wodnej w temperaturze 37°C przez 15 min, a następnie w bloku grzewczym w temperaturze 90°C przez 2 min. Natychmiast umieść probówki na lodzie na 5 min.
3. Odwiruj probówki w temperaturze 4°C przez 10 s przy 10 000 g, aby upewnić się, że DNA znajduje się na dnie probówki.

3. Deaminacja pirosiarczynowa

Sulfonacja i deaminacja hydrolityczna

1. Przygotować świeże roztwory 10 mM chinolu oraz nasyconego pirosiarczynu sodu o pH 5,0 (7,6 g Na₂S₂O₅ z 464 μl 10 M NaOH, uzupełnione wodą do objętości 15 ml). Roztwór nasyconego pirosiarczynu sodu otrzymuje się poprzez delikatne odwracanie mieszaniny odczynnika z H₂O, przy minimalnym mieszaniu i napowietrzaniu. W razie potrzeby skorygować pH za pomocą 10 M NaOH, aby zapewnić pełne rozpuszczenie pirosiarczynu. Uwaga: Ponieważ jest to roztwór nasycony, mogą pozostać nierozpuszczone małe grudki.
2. Do zdenaturowanego DNA (20 μl) dodać 208 μl nasyconego pirosiarczynu oraz 12 μl 10mM chinolu, do końcowej objętości 240 μl, tak aby uzyskać końcowe stężenie 2,31M pirosiarczynu/0,5mM chinolu, pH 5,0. Delikatnie wymieszać wszystkie odczynniki i wirować przez 10 s, aby upewnić się, że wszystkie kropelki znajdują się na dnie probówki.
3. Przykryć próbki 200 μl oleju mineralnego. Inkubować próbki w kąpieli wodnej w temperaturze 55°C przez 4-16 h. Czas traktowania pirosiarczynem zależy od ilości i jakości DNA przeznaczonego do konwersji. W przypadku DNA słabej jakości lub zdegradowanego, ograniczyć czas inkubacji do 4 h. Uwaga: Ważne jest, aby konwersja pirosiarczynem odbywała się w ciemności w celu uniknięcia utleniania; jeśli nie jest to możliwe, przed inkubacją owinąć probówki folią.
4. Po odpowiednim czasie inkubacji krótko wirować probówki w mikrocentry fudze, aby upewnić się, że cały płyn znajduje się na dnie probówki.
5. Odzyskać DNA traktowane pirosiarczynem spod warstwy oleju, ostrożnie pipetując roztwór DNA z dna probówki, tak aby nie pobrać oleju mineralnego.

Odsalanie

5. Usuń wszelkie wolne jony pirosiarczynowe, przepuszczając próbkę przez kolumnę odsalającą i eluując w 50 μl wody milli-Q (MQH₂O). W zależności od ilości i jakości DNA genomowego oraz sposobu jego przygotowania można zastosować różne kolumny odsalające. My rutynowo stosujemy kolumny Promega Wizard Clean up, ponieważ nadają się one do usuwania SDS użytego podczas przygotowania DNA przed konwersją.

Alkaliczna desulfonacja

6. Produkt addycji pirosiarczynu jest usuwany z pierścienia uracylu poprzez desulfonację. Przeprowadź desulfonację, dodając 5,5 μl świeżo przygotowanego 3M NaOH do stężenia końcowego 0,3M, a następnie inkubuj próbki w temperaturze 37°C przez 15 min.
7. Krótko odwiruj i dodaj 1 μl tRNA (10 mg/ml).
8. Zneutralizuj roztwór poprzez dodanie 33 μl octanu amonu (NH₄O Ac), pH 7,0 do stężenia końcowego 3M.
9. Wytrąć DNA etanolem, dodając 330 μl lodowatego 100% etanolu; wymieszaj dokładnie poprzez odwracanie probówki. Pozostaw w temperaturze -20μC na 1 h lub przez noc. Centryfuguj przy 14 000 g przez 15 min w temperaturze 4°C. Usuń wszystkie ślady supernatantu i wysusz osad DNA przez ok. 20 min.
10. Resuspenduj pellet DNA w 50 μl/μg 0,1 TE (10mM Tris-HCL, 0,1mM EDTA, pH 8,0) lub H₂O. Pozostaw w temperaturze pokojowej przez około 2 h. Co jakiś czas mieszaj probówki na wirówce typu vortex, aby upewnić się, że DNA zostało rozpuszczone, a następnie krótko odwiruj.
11. Wykorzystaj natychmiast do amplifikacji PCR lub przechowuj w temperaturze -20°C przez okres od 1 do 10 lat, w zależności od ilości i jakości DNA.

4. Amplifikacja PCR

Projektowanie starterów

1. Efektywne projektowanie starterów specyficznych dla konwersji bisulfitowej w PCR jest kluczowe dla zapewnienia wydajnej i nieobciążonej amplifikacji całkowicie skonwertowanego DNA. Poniższe wytyczne służą jako pomoc w projektowaniu starterów.

Wytyczne dotyczące projektowania starterów

Termocyklowanie

2. Aby sprawdzić proporcjonalność amplifikacji PCR metylowanego i niemetylowanego DNA, należy użyć kontrolnej próbki z DNA całkowicie konwertowanego bisyulfitowo w stosunku 50:50 (metylowany/niemetylowany) i przeprowadzić amplifikację przy użyciu starterów specyficznych dla konwersji bisyulfitowej w zoptymalizowanych warunkach reakcji PCR (Rysunek 3). W przypadku kontroli 50:50 (metylowany:niemetylowany) należy zastosować DNA zmetylowane za pomocą SssI in vitro oraz DNA amplifikowane w całej genomie (WGA) lub DNA z krwi pełnej. Należy pamiętać, że niektóre geny są naturalnie zmetylowane we krwi, dlatego w takich przypadkach najlepiej użyć DNA WGA jako kontroli „niemetylowanej”.
3. Przygotować mieszaniny reakcyjne do amplifikacji PCR w aliquotach po 100 μl zawierających 2 μl konwertowanego bisyulfitowo DNA genomowego, 200 μM dNTP, 1 μM starterów, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10mM Tris-HCL, pH 8,3 oraz 0,15 μl polimerazy Taq.
4. W termocyklerze z gradientem temperatury ustawić reakcję w gradiencie +/- 3°C od przewidywanej Tm startera w 10 probówkach.

5. Aby sprawdzić, czy amplikony zmetylowane i niezmetylowane zostały powielone proporcjonalnie, można poddać amplikon trawieniu odpowiednim enzymem restrykcyjnym, takim jak Taq 1 (TCGA), który trawi zmetylowane DNA, ale nie trawi niezmetylowanego DNA, gdy miejsce rozpoznawania enzymu ulegnie zmianie na TTGA po konwersji bisulfitowej. Stopień trawienia można zwizualizować za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (Rycina 3A). Alternatywnie, do reakcji PCR można dodać SYBRGreen (0,2 μl w rozcieńczeniu 1:1000), a stopień metylacji można ocenić, wykonując wykresy dysocjacji termicznej w termocyklerze do real-time PCR (Rycina 3B).
6. Mieszaninę reakcyjną PCR, w tym stężenie MgCl₂, oraz warunki termocyklowania może być konieczne dostosować w celu zwiększenia wydajności PCR lub zapewnienia proporcjonalnej amplifikacji zmetylowanych i niezmetylowanych fragmentów PCR.
7. Po optymalizacji warunków PCR można przeprowadzić amplifikację PCR w próbkach poddanych konwersji bisulfitowej. Uwaga: Po optymalizacji Tm nie ma konieczności stosowania PCR z gradientem temperatury.

5. Reprezentatywne wyniki:

Przykład optymalizacji amplifikacji PCR po konwersji pirosiarczynowej przedstawiono na rysunku 3. Optymalne warunki amplifikacji PCR powinny pozwalać na proporcjonalną amplifikację amplikonów zmetylowanych i niezmetylowanych, bez wprowadzania błędu systematycznego. Rysunek 3A przedstawia żel agarozowy z profilem amplifikacji PCR w gradiencie temperatury dla mieszaniny 50% zmetylowanego i niezmetylowanego DNA. Amplikony PCR zostały poddane trawieniu enzymem restrykcyjnym Taq 1 (TCGA), który trawi zmetylowane (M) DNA, ale nie trawi niezmetylowanego (U) DNA, ponieważ miejsce rozpoznawania enzymu zostaje zmienione podczas konwersji pirosiarczynowej na TTGA. Przewiduje się uzyskanie równej ilości produktu PCR pociętego i niepociętego, jeśli DNA zmetylowane i niezmetylowane zostanie amplifikowane proporcjonalnie. Na tym żelu widać, że optymalne warunki termocyklingu dla bezstronnej amplifikacji występują przy 56,1°C (T). Kompletność konwersji pirosiarczynowej DNA można również analizować poprzez trawienie enzymem specyficznym dla miejsca cytozyny, takim jak HpaIII (CCGG). HpaIII trawi DNA tylko wtedy, gdy konwersja nie powiodła się, ponieważ miejsce restrykcyjne zostaje zachowane. Jeśli konwersja jest kompletna, miejsce restrykcyjne zostanie zmienione na TCGG lub TTGG, w zależności od stanu metylacji DNA. Kompletna konwersja pirosiarczynowa DNA jest widoczna na rysunku 3A (H).

Rysunek 3B przedstawia wykres dysocjacji w czasie rzeczywistym, który może służyć jako narzędzie do określenia, czy występuje jakiekolwiek obciążenie amplifikacją (amplification bias) na podstawie temperatury, w której dysocjują poszczególne cząsteczki. Na tym rysunku widać, że PCR amplifikował zmetylowane (M) i niezmetylowane (U) DNA proporcjonalnie z mieszaniny 50% DNA zmetylowanego i niezmetylowanego w porównaniu do kontrolnej amplifikacji w pełni zmetylowanego i niezmetylowanego DNA, które dysocjują odpowiednio w 82,1μC i 78,9μC.

Po optymalizacji termocyklingu i warunków reakcji próbki poddane działaniu pirosiarczynu można amplifikować za pomocą starterów specyficznych dla nici i dla pirosiarczynu w pojedynczej lub półgniazdowej reakcji PCR. Powstałe fragmenty PCR można zwizualizować za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i zsekwencjonować bezpośrednio (Rysunek 4A) lub poprzez klonowanie i sekwencjonowanie. Po klonowaniu i sekwencjonowaniu stan metylacji poszczególnych cząsteczek można zestawić w formie mapy pirosiarczynowej (Rysunek 4B), aby zwizualizować heterogeniczność metylacji.

Wysokoprzepustową ilościową analizę metylacji można przeprowadzić przy użyciu technologii takich, jak ta wykorzystywana w metodzie Sequenom EpiTYPER. W tej metodzie DNA poddane konwersji pirosiarczynowej jest amplifikowane za pomocą swoistych dla konwersji pirosiarczynowej starterów PCR, a następnie poddawane zastrzeżonemu procesowi cięcia. Powstałe fragmenty są ilościowo oznaczane za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF, przy czym konkretne widmo zależy od obecności zmetylowanych cytozyn (Rycina 5A). Podsumowanie stopni metylacji w próbce można następnie przedstawić w formie Epigramu (Rycina 5B) lub wykresu metylacji (Rycina 5C).

Rysunek 1. Schemat zmetylowanych CpG. W normalnej komórce wyspy CpG związane z promotorem są przeważnie niezmetylowane (szare), natomiast miejsca CpG w obrębie ciał genów występują rzadko i są zazwyczaj zmetylowane (czerwone). Panel po prawej stronie powiększa strukturę molekularną DNA w pojedynczym miejscu CpG i pokazuje metylację z cząsteczką CH3 przy węglu 5 cytozyny.

Rysunek 2. Schemat konwersji chemicznej. Analiza metylacji DNA obejmuje cztery główne etapy, jak pokazano na schemacie: denaturację, konwersję pirosiarczynową, amplifikację PCR oraz analizę. Na prawym panelu przedstawiono modyfikacje cząsteczki cytozyny, które zachodzą podczas konwersji pirosiarczynowej.

Rycina 3. Optymalizacja amplifikacji PCR. A. Elektroforeza na żelu agarozowym z profilem amplifikacji PCR w gradiencie temperatury dla mieszaniny 50% zmetylowanego i niezmetylowanego DNA. Fragmenty zostały poddane trawieniu za pomocą Taq1 (T) lub HpaIII (H), które trawią odpowiednio zmetylowane DNA oraz DNA niepoddane konwersji pirosiarczynowej. B. Analiza krzywej dysocjacji termicznej wykazuje równą proporcję zmetylowanego i niezmetylowanego DNA (czerwona linia, mieszanina 50/50) w porównaniu do kontrolnej amplifikacji w pełni zmetylowanego (różowa linia, M) i niezmetylowanego DNA (zielona linia, U), które dysocjują odpowiednio w 82,1°C i 78,9°C.

Rycina 4. Przykład sekwencjonowania bezpośredniego i mapy pirosulefitowej. A. Ślady sekwencji z trzech różnych linii komórkowych z zaznaczonymi na żółto miejscami CpG. Linia komórkowa X wykazuje 100% metylacji we wszystkich trzech miejscach CpG, podczas gdy linie komórkowe Y i Z wykazują różny stopień metylacji, co widać po nakładających się sygnałach G/A. B. Reprezentatywna mapa pirosulefitowa przedstawiająca gęstość metylacji (czerwone kropki) w poszczególnych miejscach CpG, wyznaczoną poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie poszczególnych klonów.

Rycina 5. Wysokoprzepustowa analiza metylacji DNA z użyciem systemu Sequenom. A. Widok widma z zastosowaniem technologii Sequenom epiTYPER. Fragmenty DNA wykazują specyficzne widma w zależności od stopnia metylacji DNA. B. Epigram podsumowujący procent metylacji DNA w każdym miejscu CpG dla czterech różnych linii komórkowych. C. Podsumowujący wykres metylacji wygenerowany z programu Sequenom Epigram.

Dyskusja

Analiza metylacji DNA poprzez sekwencjonowanie genomiczne DNA poddanego konwersji pirosiarczynowej jest ugruntowaną i wszechstronną metodą, która umożliwia identyfikację i kwantyfikację metylacji DNA z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu. Jednak konwersja pirosiarczynowa i późniejsza analiza opierają się na założeniu, że DNA zostało w pełni przekształcone, przy czym każda niezmetylowana cytozyna została zdeaminowana do uracylu, a jedynie cytozyny zmetylowane pozostały niereaktywne. W przypadku niepełnej konwersji mogą pojawić się problemy z analizą, ponieważ nieprzekształcone niezmetylowane cytozyny mogą zostać błędnie zinterpretowane jako cytozyny zmetylowane. Konwersję pirosiarczynową można optymalizować na różnych etapach, aby zmaksymalizować procent konwersji. Aby DNA zostało w pełni przekształcone, musi ono najpierw stać się jednoniciowe, tak aby reszty cytozyny były wystawione na działanie jonów pirosiarczynu. Pierwszy krok, czyli denaturacja DNA, jest krytyczny i może być przyczyną niepełnej konwersji, jeśli DNA nie zostanie całkowicie zdenaturowane. Aby zapewnić pełną denaturację DNA, istotne jest, aby parametry reakcji, w tym usunięcie wszystkich związanych białek, odpowiednie stężenie soli, temperatura i czas inkubacji, były dostosowane do utrzymania DNA w konformacji jednoniciowej. Ważne jest stosowanie świeżego 3M NaOH oraz zapewnienie odpowiedniego czasu inkubacji. Jeśli DNA stawia opór denaturacji, niektóre modyfikacje protokołu, takie jak wydłużenie czasu inkubacji do 30 minut lub fragmentacja DNA przed denaturacją, mogą ułatwić ten proces. Ponadto jednoniciowe DNA (ssDNA) może ponownie ulec hybrydyzacji do dwuniciowego DNA (dsDNA) podczas reakcji konwersji pirosiarczynowej. Prowadzenie reakcji w wyższej temperaturze (90-95°C), okresowo lub w sposób ciągły podczas reakcji pirosiarczynowej, może pomóc w utrzymaniu ssDNA. Należy jednak pamiętać, że w tych wyższych temperaturach degradacja DNA ulega znacznemu przyspieszeniu. Można również dodać różne odczynniki, takie jak mocznik, aby zapobiec ponownej hybrydyzacji nici DNA.

Stężenie DNA oraz jego jakość mogą również wpływać na wydajność reakcji konwersji pirosiarczynowej i ostateczną wydajność PCR. Degradacja DNA stanowi ograniczenie protokołu konwersji pirosiarczynowej. Obróbka chemiczna DNA powoduje liczne pęknięcia nici w ssDNA, a niektóre z rygorystycznych warunków niezbędnych do pełnej konwersji pirosiarczynowej, w tym wysokie stężenie pirosiarczynu oraz długie czasy inkubacji, mogą przyspieszać degradację DNA. W opisanych standardowych warunkach reakcji degradacja DNA nie jest częstym problemem, jednakże w przypadku wprowadzenia modyfikacji protokołu, np. dla sekwencji opornych na konwersję lub dla matryc DNA zdegradowanych bądź słabej jakości, takich jak próbki FFPE, degradacja DNA może stać się znaczącym ograniczeniem.

Próbki DNA utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie (FFPE) oraz próbki zdegradowane mogą być skutecznie poddane konwersji pirosiarczynowej i amplifikacji zgodnie z tym protokołem, jednak zaleca się wprowadzenie modyfikacji zapobiegających dalszej degradacji DNA. Rekomendowane jest użycie nośnika RNA, takiego jak tRNA. W przypadku niskiego stężenia DNA (<200 ng) jako nośnik można dodać glikogen. Ponieważ DNA izolowane z tkanek FFPE jest już pofragmentowane, a dalsza fragmentacja zachodzi podczas deaminacji, należy zachować ostrożność, aby zminimalizować dalszą degradację. Nie należy dodatkowo fragmentować DNA przed denaturacją i należy ograniczyć czas inkubacji reakcji pirosiarczynowej do 4 godzin. Ze względu na pofragmentowany charakter DNA, należy projektować amplikony o długości nieprzekraczającej 300 bp.

Kolejnym czynnikiem mogącym wpływać na amplifikację PCR jest konwersja niezmetylowanych cytozyn za pomocą pirosiarczynu, która zmniejsza złożoność matrycy DNA. Opisany w sekcji 4.1 protokół projektowania starterów, zwiększenie długości starterów oraz PCR gniazdowy mogą pomóc w zwiększeniu swoistości i wydajności PCR.

Wreszcie, ponieważ matryca DNA ulega zmianie podczas konwersji pirosiarczynowej, problemem może być błąd amplifikacji. Należy upewnić się, że proporcjonalna amplifikacja PCR matryc zmetylowanych i niezmetylowanych została sprawdzona przy użyciu kontrolnej mieszaniny DNA M/U w stosunku 50/50, zgodnie z opisem w protokole (patrz Rysunek 3). Należy również potwierdzić za pomocą enzymu restrykcyjnego HpaIII i elektroforezy żelowej, że zachodzi amplifikacja wyłącznie matryc poddanych konwersji (Rysunek 3). Warunki PCR mogą wymagać optymalizacji poprzez zmianę temperatury i/lub stężenia magnezu lub wydłużenie czasu elongacji. Niektóre matryce mogą okazać się szczególnie problematyczne, co może wymagać skorygowania pozycji starterów lub zastosowania starterów zdegenerowanych.

Techniki sekwencjonowania następnej generacji ewoluują w szybkim tempie, aby osiągnąć rozdzielczość zbliżoną do sekwencjonowania genomicznego z użyciem pirosiarczynu, a sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek trzeciej generacji ma potencjał, aby umożliwić analizę zarówno pierwotnego DNA, jak i metylacji bez konieczności stosowania sekwencjonowania z pirosiarczynem. Jednak powszechna dostępność i specyficzność tych technik pozostają kwestią przyszłości. Sekwencjonowanie genomiczne z użyciem pirosiarczynu jest złotym standardem w analizie metylacji i stanowi solidny protokół. Metoda ta rozwinęła się do stopnia, w którym powszechne problemy i ograniczenia zostały rozwiązane, a zastosowania rozszerzyły się z analiz pojedynczych genów na analizy wysokoprzepustowe i całego genomu, opisane przez Clark et al. 2006⁴. Wytyczne dotyczące rozwiązywania problemów oraz dodatkowe zalecenia przedstawiono w Tabeli 1. Sugeruje się, aby optymalnym podejściem było początkowe stosowanie standardowego protokołu i wprowadzanie modyfikacji tylko wtedy i w przypadku wystąpienia problemów.

Tabela 1. Wytyczne dotyczące rozwiązywania problemów

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nazwa materiału	Typ
Pirosiarczyn sodu	Ajax Finechem
Hydrochinon	Merck & Co., Inc.
Zestaw do oczyszczania DNA Wizard	Promega Corp.