Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa do celowanej edycji genów neuronalnych w mózgu myszy

Streszczenie

Źródło: Fricano-Kugler, C. J., et al. Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa w celu precyzyjnej edycji genów neuronalnych w mózgu myszy. Protokół zapewnia dokładne dostarczanie wirusa do zakrętu zębatego, umożliwiając znakowanie fluorescencyjne i nokaut genów za pośrednictwem CRISPR w celu badania obwodów neuronalnych, funkcji genów i mechanizmów chorobowych in vivo.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Wstrzyknięcie stereotaktyczne

1. Upewnij się, że wentylacja sali operacyjnej jest otwarta, aby zapewnić prawidłowy przepływ powietrza. Przygotuj mysz do zabiegu, znieczulając ją 4% izofluranem w komorze indukcyjnej. Po znieczuleniu należy ogolić głowę, aby przygotować miejsce wstrzyknięcia.
   1. Umieść mysz w instrumencie stereotaktycznym za pomocą pęsety, aby przesunąć język w dół i na bok. Włóż pręt do gryzienia do ust, aż zęby wpadną do szczeliny, a następnie zabezpiecz nauszniki. Upewnij się, że korpus myszy znajduje się na poduszce grzewczej, a nos znajduje się w stożku nosowym. Skierować 4% izofluranu do stożka nosowego. Potwierdź znieczulenie, szczypiąc stopę pęsetą i upewniając się, że nie ma odruchu zaskoczenia.
   2. Zastosuj sztuczne łzy, aby nawilżyć oczy. Przygotowanie miejsca wstrzyknięcia należy zakończyć, pobierając z ogolonej głowy wymaz z naprzemiennymi rundami jodu powidonu i lidokainy.
2. Za pomocą skalpela wytnij małe nacięcie wzdłuż środka skóry głowy. Osusz czaszkę wacikiem i wodą utlenioną, jeśli to konieczne, aby pomóc w wizualizacji bregmy.
   1. Korzystając z lunety do preparacji, zlokalizuj bregmę na czaszce i umieść końcówkę wiertła na bregmie. Wyzeruj (lub zapisz) cyfrowe współrzędne stereotaktyczne na płaszczyznach x, y i z.
   2. Aby upewnić się, że głowica jest wypoziomowana na osi y rostralnej do ogonowej, umieść wiertło na lambda i wypoziomuj głowicę tak, aby współrzędna z była mniej więcej równa zarówno przy bregmie, jak i lambdzie.
   3. Aby upewnić się, że głowica jest wypoziomowana na osi x, umieść wiertło na pozycji y = 1/2 lambda. Upewnij się, że współrzędna z jest równa 1 mm z każdej strony (x = +/-1 mm) szwu strzałkowego. Wyreguluj czaszkę, jeśli występuje różnica we współrzędnej z w odległości 1 mm po lewej i prawej stronie lambda.
3. Umieść wiertło nad żądanymi współrzędnymi. Dla zakrętu zębatego użyj współrzędnych y = -1.9 z bregma i x = +/- 1.1. Przed wierceniem obniż izofluran do 2%, a następnie powoli i ostrożnie przewiercić czaszkę.
   1. Po wywierceniu wszystkich otworów, przymocuj wypełnioną strzykawkę do instrumentu stereotaktycznego. Wizualnie wyśrodkuj strzykawkę nad otworem i wyzeruj współrzędną z na czaszce.
   2. Powoli opuścić strzykawkę do najgłębszej głębokości z. W przypadku zakrętu zębatego głębokości z wynoszą -2,5, -2,4 i -2,3. Rozpocząć wstrzykiwanie z szybkością 0,25 μl/min za pomocą wtryskiwacza stereotaktycznego.
      1. Po zakończeniu iniekcji na najniższej głębokości Z, odczekaj 1 minutę, a następnie podnieś do następnej współrzędnej i rozpocznij wstrzykiwanie ponownie. Kontynuuj ten wzór, aż wszystkie współrzędne wtrysku z zostaną wstrzyknięte. Odczekaj 2 minuty przed wyjęciem strzykawki po ostatnim wstrzyknięciu.
         UWAGA: Nie zaobserwowano żadnych działań niepożądanych na tkankę po wstrzyknięciu do 2 μl wirusa na półkulę do mózgu myszy.
   3. Powtórz iniekcję dla innych odwiertów.
4. Po wstrzyknięciu wyjmij mysz z instrumentu stereotaktycznego i zszyj skórę głowy jedwabnymi szwami 6-0. Nałóż lidokainę i krem antybakteryjny na ranę.
   1. Wstrzyknąć 0,8-1,0 ml soli fizjologicznej + ketoprofenu (3-5 mg/kg) drogą dootrzewnową (I.P.), aby poradzić sobie z bólem. Następnie umieść mysz w podgrzewanej komorze odzyskiwania. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą w mostku. Nie należy zwracać zwierzęcia do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Stereotaktyczne odczynniki
Vet-Strzykawka weterynaryjna używa tylko strzykawki T.B. 1cc luer slip T.B. 100/bx	Med-Vet International	1CCVLS
Isofluran
Ostrza skalpela ze stali nierdzewnej, #10, 100 szt	Med-Vet International	JOR580S
Maść na sztuczne łzy	Med-Vet International	RXPARALUBE-O
PVP PrepSolution	Med-Vet International	HPIV108208H
Sól fizjologiczna naturalna	Med-Vet International	DYND500MLSH
Aplikatory z końcówką bawełnianą	Med-Vet International	CTA6
Maść z potrójnym antybiotykiem	Med-Vet International	RXTRIP-OI15
MONOJECT® Igły Soft Pack 25g x 5/8"	Med-Vet International	25058
6-0 nici jedwabne	Med-Vet International	MV-711

chirurgiczne.