$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Znakowanie mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) nanocząstkami superparamagnetycznego tlenku żelaza (SPIO)
- Aby oznaczyć MSC za pomocą SPIO, dodać 6 ml pożywki do znakowania (25 μg/ml SPIO w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco bez płodowej surowicy bydlęcej (FBS)) do kolby T75 zawierającej MSC (80% konfluencji).
- Inkubować komórki z pożywką do etykietowania w inkubatorze CO2 (37 °C, 5 % CO2 ) bez wstrząsania. Po 24 godzinach delikatnie usuń nośnik do etykietowania za pomocą sterylnej pipety Pasteura z plastikową końcówką podłączoną do próżni. Przemyj komórki jednowarstwowo 2x 6 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby usunąć wszelkie ślady niezinternalizowanego SPIO.
- Aby ustalić, czy komórki zostały pomyślnie oznaczone, sprawdź oznaczone komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym lub konfokalnym, jeśli SPIO jest oznaczone fluoroforem (np. jak te używane tutaj; Rysunek 1B, C).
- Zebrać przylegające komórki przez potraktowanie 3 ml trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C. Po 5 minutach inkubacji dodaj 7 ml wstępnie podgrzanej pożywki DMEM z 10% FBS (v/v), aby dezaktywować trypsynę. Zawiesinę komórek pobrać za pomocą pipety do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Odwirować zawiesinę komórek o sile 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS. Policz żywe komórki za pomocą niebieskiego barwnika trypanowego i hemocytometru.
UWAGA: Osad komórek oznaczonych komórek będzie miał ciemny kolor z powodu obciążenia żelazem (Rysunek 1D). Protokół ten jest odpowiedni dla znakowania MSC i obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI). Procedura znakowania MSC została wcześniej zoptymalizowana i uwzględniono tutaj tylko kroki mające na celu przygotowanie oznakowanych MSC do śledzenia in vivo, ponieważ śledzenie in vivo jest w centrum uwagi. Protokół hodowli i znakowania innych typów komórek powinien być zoptymalizowany przez badacza. - Dostosuj stężenie komórek za pomocą PBS do 150 000 komórek (lub liczby, która daje wystarczający sygnał MRI) w 18 μl PBS (lub całkowitej objętości, która zostanie wykorzystana w procedurze podawania donosowego).
UWAGA: Zauważono, że stężenie komórek wyższe niż 150 000 komórek/18 μL PBS prowadzi do agregacji komórek, co może wpływać na skuteczność podawania donosowego. Jeśli do podania donosowego potrzebna jest większa liczba komórek, należy zwiększyć całkowitą objętość zawiesiny komórkowej i zwiększyć liczbę podań donosowych, ponieważ podanie donosowe jest procedurą nieinwazyjną i możliwe jest wielokrotne dawkowanie.
2. Uraz kontrolowanego wpływu na korę mózgową (CCI)
UWAGA: W tym protokole samce myszy C57 BL/6 (w wieku 7-8 tygodni) były trzymane w cyklu 12/12 godzin światło/ciemność z dostępem ad libitum do pożywienia i wody.
- Aby przygotować każdą mysz na uraz CCI, należy podać zolazepam (50 mg/kg) i ksylazynę (20 mg/kg) koktajl znieczulający poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.) (1 ml/kg). Upewnij się, że głębokość znieczulenia jest wystarczająca przy braku reakcji na uszczypnięcie palca. Alternatywnie umieść mysz w komorze zaopatrzonej w 2%-4% izofluranu na 60 sekund.
- Ogol sierść na grzbietowej powierzchni czaszki między uszami za pomocą elektronicznej maszynki do strzyżenia włosów. Kilkakrotnie wyczyść ogolony obszar za pomocą sterylnego wacika nasączonego jodem. Użyj bawełnianego wacika nasączonego 70% etanolem, aby usunąć jod.
- Umieść znieczuloną mysz w ramce stereotaktycznej i zabezpiecz mysz za pomocą nauszników i pasków na nos. Wykonaj nacięcie śródstrzałkowe (około 2,5 cm) w ogolonej skórze za pomocą sterylnych nożyczek, aby uzyskać dostęp do powierzchni czaszki.
- Usuń tkankę z kości za pomocą wacika, aby odsłonić czaszkę. Oczyść powierzchnię czaszki za pomocą bawełnianego wacika nasączonego 3% nadtlenkiem wodoru (H2O2) przez 10 sekund, a następnie wyczyść ją suchym wacikiem.
UWAGA: Szwy czaszki oraz zarówno bregma, jak i lambda można teraz łatwo zidentyfikować. - Zidentyfikuj wybrane współrzędne na powierzchni czaszki dla urazu CCI i narysuj okrąg (o średnicy 4 mm) wokół współrzędnych za pomocą ołówka lub odpowiedniego markera.
UWAGA: W tym protokole do indukcji CCI użyto współrzędnych przednio-tylnych (AP) -2,0 mm i przyśrodkowo-bocznych (ML) +1,5 mm. - Użyj mikrowiertła i okrągłego zadzioru (średnica 0,5 mm), aby rozrzedzić czaszkę w zaznaczonym okręgu. Unikaj wywierania nacisku podczas wiercenia, ponieważ wiercenie w kości może spowodować uszkodzenie miąższu mózgu. Usuń kurz kostny za pomocą czystego i suchego bawełnianego wacika.
- Delikatnie usuń płat kostny za pomocą sterylnych cienkich kleszczy, aby odsłonić oponę twardą, zachowując ją w stanie nienaruszonym. Wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej, która była używana do przygotowania przed urazem i umieść ją w ramce stereotaktycznej urządzenia CCI.
- Ustabilizuj głowę myszy za pomocą nauszników i pasków na nos. Upewnij się, że główka myszy jest wypoziomowana w kierunku rostralno-ogonowym i w razie potrzeby wyreguluj paski nosowe.
- Postępuj zgodnie z instrukcjami na skrzynce sterowniczej, aby wyzerować końcówkę impaktora do odsłoniętej powierzchni kory mózgowej. Upewnij się, że końcówka udaru jest wyrównana bezpośrednio nad żądanymi współrzędnymi kory mózgowej, w które ma zostać uderzona, za pomocą pokręteł sterujących X i Y na podstawie impaktora.
- Ustaw parametry eksperymentu za pomocą skrzynki kontrolnej z prędkością 5 m/s, czasem przebywania 250 ms i głębokością urazu 1 mm, aby wywołać łagodne obrażenia myszy.
- Wywołaj obrażenia, naciskając przycisk "uderzenie" na skrzynce sterowniczej. Wymaz wszelkie krwawienia, które wystąpią, za pomocą sterylnego bawełnianego wacika.
- Wyjmij mysz z ramy stereotaktycznej i zamknij nacięcie za pomocą jedwabnych szwów chirurgicznych. Nie używaj metalowych klipsów do zamykania pola operacyjnego, ponieważ mysz zostanie poddana działaniu pola magnetycznego do rezonansu magnetycznego.
- Stosować miejscowo antybiotyki (bacytracyna, neomycyna) na miejsce operowane, aby zapobiec infekcjom. Trzymaj mysz na poduszce grzewczej i uważnie ją monitoruj podczas fazy odzyskiwania.
- Ketoprofen (2,5 mg/kg, IP) należy podawać codziennie przez 3 dni po zabiegu, chyba że podanie ketoprofenu jest sprzeczne z celami badania.
3. Podanie donosowe W
- 1 dniu po indukcji CCI podaj koktajl znieczulający zolazepam (50 mg / kg) i ksylazynę (20 mg / kg) przez wstrzyknięcie dożylne. Upewnij się, że mysz jest głęboko znieczulona z powodu braku reakcji na uszczypnięcie palca.
- Przygotuj mysz do donosowego podawania MSCs za pomocą leczenia hialuronidazą.
- Chwyć za kark myszy i mocno obróć ją na plecy, jednocześnie unieruchamiając czaszkę. Umieść końcówkę pipety zawierającej hialuronidazę w sterylnym PBS (4 U/μL) w pobliżu nozdrza myszy pod kątem 45°.
- Podać 3 μl zawiesiny hialuronidazy do każdego nozdrza. Trzymaj mysz unieruchomioną i skierowaną do góry na czystej podkładce przez 5 minut. Powtórz zabieg hialuronidazy 4x (łącznie 100 U zawiesiny hialuronidazy).
- Po leczeniu hialuronidazą należy trzymać leczoną mysz na czystej podkładce skierowanej do góry przez 30 minut.
- Aby dostarczyć MSC do mózgu, przytrzymaj mocno mysz, jak opisano w kroku 3.2.1. Podawać 3 μl/nozdrze zawiesiny MSC w odstępie 3 s. Trzymaj mysz w tej samej pozycji przez 30 sekund, aż krople próbki całkowicie znikną.
UWAGA: Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas podawania. - Powtórzyć podawanie w odstępie 2 minut do 3x,
UWAGA: Całkowita liczba komórek, które mają zostać dostarczone, wynosi 150 000, tak że 18 μl zawiesiny komórek można dostarczyć w dawce 3 μl dla każdego nozdrza, po 3 razy każda. - Umieść mysz z powrotem w klatce i uważnie ją monitoruj, aż w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia.
