Podawanie leków neuroterapeutycznych opartych na pompie osmotycznej w zdemielinizowanym modelu myszy

Streszczenie

Źródło: Wang, X. et. al., Dostarczanie leków oparte na pompie osmotycznej w badaniach remielinizacji in vivo na ośrodkowym układzie nerwowym. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film przedstawia metodę dostarczania leków neuroterapeutycznych za pomocą pompy osmotycznej w zdemielinizowanym modelu myszy. Kontrolowane uwalnianie leku sprzyja remielinizacji poprzez aktywację komórek wytwarzających mielinę w ciele modzelowatym.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Ustanowienie mysiego modelu demielinizacji indukowanej lizolecytyną

1. Przygotować 1% roztwór lizolecytyny (zwanej również L-α-lizofosfatydylocholiną) ze sterylną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
2. Sterylizuj nożyczki, kleszcze, zakrzywione hemostatyki i inne narzędzia chirurgiczne przez sterylizację w autoklawie. Wysterylizuj obszar operacyjny i połóż sterylne prześcieradła. Wszystkie materiały i odczynniki używane do zabiegu chirurgicznego powinny być przygotowane w warunkach aseptycznych. Ważne jest, aby obszar operacyjny był sterylny przez cały czas trwania zabiegu.
3. Znieczulenie myszy C57BL6 w dniu poporodowym 56 (P56) w następujący sposób.
   1. Umieść mysz w komorze izofluranu maszyny do znieczulania małych zwierząt. Dostosuj przepływ_O2 do 300-500 ml/min, a izofluranu do 3%-4%. Po wystarczającym znieczuleniu, gdy mysz stanie się nieruchoma z powolnym i stabilnym oddechem, przenieś mysz do aparatu stereotaktycznego z poduszką grzewczą.
   2. Przełącz wydatek gazu z komory na maskę anestezjologiczną i dostosuj izofluran do 1%-1,5%, aby utrzymać mysz w stanie znieczulenia. Poczekaj, aż mysz zostanie w pełni znieczulona, a następnie wstrzyknij ketoprofen (3-5 mg / kg) dootrzewnowo, aby złagodzić ból. Przed operacją uszczypnij palce myszy i sprawdź jej reakcję, aby potwierdzić skuteczne znieczulenie.
   3. Kiedy mysz jest znieczulona, nie może regulować temperatury ciała. Dlatego monitoruj i reguluj temperaturę ciała myszy podczas zabiegu. Przykryj powierzchnię gałek ocznych myszy maścią do oczu z erytromycyną, aby gałki oczne były wilgotne podczas znieczulenia.
4. Zabezpiecz główkę myszy w aparacie stereotaktycznym za pomocą listwy zębatej i nauszników. (Rysunek 1A).
5. Użyj maszynki do golenia, aby usunąć włosy z czubka głowy. Zdezynfekuj skórę głowy za pomocą trzech cykli betadyny i 75% etanolu. Ze względów etycznych należy przykryć ciało zwierzęcia z wyjątkiem miejsca operacji. Za pomocą skalpela wykonaj 1-centymetrowe nacięcie skóry w połowie strzałki od podstawy szyi do między oczami, aby odsłonić czaszkę (ryc. 1B).
6. Delikatnie przetrzyj powierzchnię czaszki sterylnym wacikiem zawierającym 30% nadtlenku wodoru, aby uwidocznić szwy czaszkowe (ryc. 1C). Dostosuj wysokość listwy zębatej i prętów usznych, aby umieścić punkt lambda i punkt bregma na tej samej wysokości (tj. z tymi samymi współrzędnymi osi z, gdy końcówka igły dotyka tych punktów), tak aby szew strzałkowy był poziomy.
7. Delikatnie umieść końcówkę igły strzykawki mikrolitrowej (10 μl, 33 G) w punkcie bregma i zresetuj współrzędne x, y i z do 0 (rysunek 1D). Przesunąć strzykawkę do miejsca wstrzyknięcia (x: 1,04; y: 1,0, tj. 1,04 mm w bok do linii środkowej i 1,0 mm do tyłu do punktu bregma) zgodnie z komunikatem odczytu cyfrowego (Rysunek 1E).
8. Powoli wywiercić mały otwór w czaszce w miejscu wstrzyknięcia, nie penetrując opony twardej za pomocą igły strzykawkowej o pojemności 1 ml (26 G, 0,45 mm) (Ryc. 1F). Powoli włóż igłę strzykawki o pojemności mikrolitra do tkanki mózgowej przez otwór, aż do osiągnięcia określonej głębokości (z = -1,62 mm dla większości myszy P56) (Rysunek 1G).
   UWAGA: Empirycznie głębokość wprowadzenia -1,62 mm pozwala końcówce igły dotrzeć do środka ciała modzelowatego większości myszy P56, dzięki czemu lizolecytyna może być bezpośrednio dostarczana do ciała modzelowatego w celu wywołania demielinizacji.
9. Wstrzyknąć 1,5 μl 1% lizolecytyny z prędkością 0,3 μl/min. Po wstrzyknięciu należy odczekać 5 minut, a następnie powoli wyciągnąć strzykawkę o pojemności mikrolitrów, aby zapobiec wyciekowi płynu wzdłuż ścieżki igły do wstrzykiwań.
10. Zszyj skórę szwami chirurgicznymi 5-0 (ryc. 1H).
11. Umieść mysz na poduszce grzewczej, aby uniknąć spadku temperatury ciała. Podawać podskórne wstrzyknięcie 5 mg/kg karprofenu co 24 godziny w celu złagodzenia bólu. Codziennie nakładaj maść z erytromycyną na nacięcie, aby zapewnić prawidłowe gojenie się rany. Umieść mysz, która przeszła operację, w samej klatce i karm ją wilgotnym pokarmem, aż w pełni wyzdrowieje. Monitoruj mysz codziennie po operacji.

2. Przygotowanie pompy osmotycznej

UWAGA: Kluczowe elementy pompy pokazano na rysunku 2A.

1. Określ głębokość wprowadzenia kaniuli infuzyjnej mózgu do mózgu. Upewnij się, że igła użytej kaniuli infuzyjnej mózgu ma długość 3 mm, a każda przekładka regulacji głębokości ma 0,5 mm. Aby uzyskać głębokość iniekcji 1,5 mm (blisko modzelowatego), przymocuj trzy przekładki do regulacji głębokości do igły kaniuli infuzyjnej mózgu za pomocą kleju tkankowego (ryc. 2B, C).
2. Aby napełnić pompę osmotyczną, należy przymocować igłę strzykawki dołączoną do opakowania z pompką do strzykawki o pojemności 1 ml i odessać lek. Trzymać pompkę pionowo, włożyć strzykawkę do otworu w górnej części pompy i powoli wstrzykiwać lek, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków (patrz Rysunek 2D). Gdy płyn wypłynie z otworu, powoli wyciągnij strzykawkę.
3. Zdejmij biały kołnierz z regulatora przepływu nożyczkami lub szczypcami, uważając, aby nie zgiąć ani nie zgniatać moderatora przepływu. Następnie włóż regulator przepływu do pompy (Rysunek 2E). Aby ustalić, czy w pompie osmotycznej znajdują się pęcherzyki, należy zważyć pompę osmotyczną oddzielnie przed i po napełnieniu.
4. Przytnij cewnik do określonej długości w zależności od wielkości zwierzęcia (cewniki 20-25 mm dla myszy P56 o wadze około 25 g). Podłącz cewnik do kaniuli infuzyjnej mózgu.
5. Napełnić cewnik lekami za pomocą strzykawki bez wprowadzania powietrza (Rysunek 2F).
6. Podłączyć cewnik do moderatora przepływu. Po założeniu upewnij się, że cewnik zakrywa około 4 mm odsłoniętego moderatora przepływu (rysunek 2G).
7. Aby mieć pewność, że pompa osmotyczna może działać natychmiast po implantacji, zanurz napełnione pompy w sterylnym 0,9% soli fizjologicznej lub PBS w temperaturze 37 °C na co najmniej 4 do 6 godzin (najlepiej przedłużając do nocy) w celu wstępnego zwilżenia półprzepuszczalnej membrany na powierzchni pompy roztworami, które mają takie samo ciśnienie osmotyczne jak środowisko tkankowe (rysunek 2H).
8. Wszystkie roztwory ładowane do pomp powinny być sterylne. Pompy ALZET są dostarczane w stanie sterylnym, po poddaniu ich działaniu sterylizującej dawki kobaltu-60. Jeśli jednak dojdzie do zanieczyszczenia zewnętrznego, powierzchnię pompy można oczyścić, przecierając ją alkoholem izopropylowym (70% w wodzie).

3. Implantacja pompy osmotycznej

1. Odczekaj 3 dni po ustaleniu modelu demielinizacji ciała modzelowatego. Włącz system znieczulenia dla małych zwierząt. Zdezynfekuj nożyczki, pęsetę i szczypce hemostatyczne i namocz je w 75% roztworze alkoholu. Połóż sterylne prześcieradła w obszarze operacyjnym.
2. Ponownie znieczulij i zabezpiecz myszy na aparacie stereotaktycznym. Pokryj powierzchnię gałek ocznych maścią do oczu, aby zapobiec wysuszeniu.
3. Zdezynfekuj pierwotną ranę 75% alkoholem. Otwórz nacięcie chirurgiczne, które zostało wcześniej zszyte (ryc. 3A) i rozszerz nacięcie na łopatki (ryc. 3B).
4. Oddziel skórę od podskórnej tkanki łącznej za pomocą szczypiec hemostatycznych lub pęsety na łopatce, aby otworzyć ubytek (ryc. 3C). Umieść pompę osmotyczną we wnęce (Rysunek 3D, E).
5. Za pomocą bawełnianego wacika delikatnie przetrzyj i odsłoń otwór na powierzchni czaszki powstały podczas ustalania modelu demielinizacji (patrz krok 1.8). Przełóż kaniulę infuzyjną mózgu przez ten otwór prostopadle i szybko przymocuj ją do czaszki za pomocą kleju tkankowego (ryc. 3F).
6. Usuń zdejmowaną zakładkę nad kaniulą infuzyjną mózgu za pomocą nożyczek (Ryc. 3G, H). Alternatywnie, przed włożeniem kaniuli najpierw usuń klapkę, aby uniknąć potrząsania podczas tego procesu.
7. Zszyj nacięcie lub przymocuj je klejem tkankowym (ryc. 3I).
8. Po zabiegu umieść mysz na poduszce grzewczej, aby uniknąć spadku temperatury ciała. Podawać podskórne wstrzyknięcie 5 mg/kg karprofenu co 24 godziny w celu złagodzenia bólu. Codziennie nakładaj maść z erytromycyną na nacięcie, aby zapewnić prawidłowe gojenie się rany. Umieść zwierzę w klatce samo i karm je wilgotnym pokarmem, aż w pełni wyzdrowieje.

Wyniki

Rysunek 1: Opracowanie mysiego modelu demielinizacji wywołanej lizolecytyną. (A) Zabezpiecz mysz w aparacie stereotaktycznym. (B) Otwórz 1 cm nacięcie w połowie pola walki, aby odsłonić czaszkę. (C) Uwido...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pompa powietrza do anestezjologii	RWD	R510-29	E05818-006
Zestaw do infuzji mózgu 3	ALZET	8851	1-3 mm
Carprofen	Macklin	C830557-1g	5 mg/kg co 24 h
Erytromycyna oko maść	Wzdłuż technologii	YCKJ-RJ-024780	Pokryj powierzchnię gałek ocznych podczas znieczulenia
Maść erytromycyna	pythonbio	RG180
Aparat do odprowadzania gazów	RWD	R546W	E05518-002
L-α-lizofosfatydylocholina	Sigma	L0906	Rozpuścić w stężeniu 1% za pomocą sterylnej
PBS Strzykawka mikrolitrowa	Hamilton	65460-05	Seria strzykawek: 1700, 10 μL, 33 gauge
Pompa mikroosmotyczna model 1002	ALZET	4317	0,25 μL na godzinę, 14 dni
PBS (pH = 7,3)	ORIGENE	ZLI-9061
Pentobarbital sodowy	Shanghai Civi	Nr CAS: 57-33-0	150-200 mg / kg wstrzyknięcie dootrzewnowe do eutanazji Aparat
do znieczulenia małych zwierząt	RWD	R520IE	E05807-006 M
Sprzęt stereotaktyczny	RWD	E06382
Sterylizator STERI 250	Keller	31101	Szybka sterylizacja narzędzi chirurgicznych
Szwy chirurgiczne	Shanghai jinhuan	F504	5-0
Igła strzykawkowa (1 ml)	Shanghai KDL	6930197811018	26 gauge (0,45 mm x 16 mm)
Testowanie leku i rozpuszczalnika	Zależny od eksperymentu
monitorowania homeotermicznego Thermostar	RWD	69026	Utrzymuj temperaturę ciała podczas znieczulenia
Klej tkankowy Vetbond	3M	1469SB	Zabezpiecz kaniulę infuzyjną mózgu i przyklej nacięcie skóry

system