Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSCs) mają potencjał do leczenia wielu różnych chorób. Użyteczność tych komórek wynika z faktu, że mogą one różnicować się w każdy typ komórek w organizmie. W niniejszym materiale opisujemy test teratomiowy, który służy do wykazania pluripotencji hPSCs.
Artykuł metodologiczny
Generowanie potworniaków w torebce jądra
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pluripotencjalne komórki macierzyste (PSCs) charakteryzują się unikalną zdolnością do różnicowania się w komórki wszystkich trzech listków zarodkowych. Dzięki temu stanowią potencjalnie cenne narzędzie w leczeniu wielu różnych schorzeń. Wraz z pojawieniem się indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs) oraz kontynuacją badań nad ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi (hESCs), pojawiła się potrzeba opracowania testów pozwalających wykazać pluripotencję konkretnej linii komórkowej. Przenoszenie w linii zarodkowej było złotym standardem demonstrowania pluripotencji linii mysich embrionalnych komórek macierzystych (mESC)1,2,3. Wykorzystując ten test, badacze mogą wykazać, że linia mESC jest w stanie wytworzyć wszystkie typy komórek w embrionie, w tym komórki zarodkowe4. Po utworzeniu ludzkich linii ESC5,6 wybór odpowiedniego testu do potwierdzenia pluripotencji tych komórek stał się nieoczywisty, ponieważ w przypadku ludzkich ESC nie można przeprowadzić testu przenoszenia w linii zarodkowej. Jako zamiennik, w celu wykazania pluripotencji ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSCs), stosuje się obecnie test teratoma7,8,9. Choć test ten został ostatnio poddany krytyce i aktywnie poszukiwane są nowe technologie, obecnie pozostaje on złotym standardem7. W tym badaniu analizowane komórki wstrzykuje się myszy z niedoborem odporności. Jeśli komórki są pluripotencjalne, z czasem rozwinie się teratoma, a w przekrojach guza będą widoczne tkanki pochodzące z trzech listków zarodkowych10. W teście teratoma hPSCs mogą być wstrzykiwane w różne obszary organizmu myszy. Do najczęstszych miejsc wstrzykiwania należą torebka jądra, torebka nerki, wątroba lub noga (podskórnie lub domięśniowo)11. W niniejszej pracy opisujemy sprawdzony protokół generowania teratom z hPSCs z wykorzystaniem torebki jądra jako miejsca wzrostu guza.
Protokół
Uwaga: Wszystkie procedury z udziałem zwierząt muszą zostać zatwierdzone przez IACUC lub równoważną jednostkę.
Wszystkie urządzenia chirurgiczne muszą zostać wysterylizowane przed operacją. Należy stosować sterylne rękawiczki, obłożenia i gazę.
1. Przygotowanie przed operacją
- Należy pozyskać 6-tygodniowe samce myszy Mus Musculus CbySmn.CB17-Prkdc SCID/J lub inną szczep myszy z niedoborem odporności.
- Wszystkie narzędzia chirurgiczne, rękawice i gazę należy wysterylizować.
- hPSC przeznaczone do wstrzyknięcia należy zdysocjować przy użyciu accutase.
- Należy policzyć komórki i zawiesić 1 000 000 komórek w 20-30 μL matrigelu rozcieńczonego 1:1 w DMEM/F-12. Komórki należy przechowywać w lodzie do momentu użycia.
- Należy pamiętać, że często przydatne jest przeprowadzenie próbnego eksperymentu z wstrzyknięciem błękitu trypanu. Pomoże to zidentyfikować potencjalne problemy przed zmarnowaniem komórek.
- W wiwariuszach myszy należy znieczulić zgodnie z procedurami przyjętymi w danej instytucji. W naszych eksperymentach wykorzystano aparat do znieczulania z izofluranem. Myszy umieszczano początkowo w komorze indukcyjnej z tlenem 1 L/min i 3-4% izofluranem. Po znieczuleniu stosowano maskę nosową z tlenem 1 L/min i 2-3% izofluranem.
- Brzuch należy ogolić trymermem, a przednią ścianę brzucha myszy oczyścić, zaczynając od środka i poruszając się zgodnie z ruchem wskazówek zegara na zewnątrz. Najpierw należy użyć roztworu povidonu-jodu, a następnie przemyć 70% etanolem. Czynność powtórzyć 3 razy, za każdym razem zmieniając tampony. Zwierzę należy przenieść na matę grzewczą, aby utrzymać jego ciepłotę wewnątrz dygestorium do hodowli tkanek lub kaptura sekcyjnego.
- Za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych należy wykonać 1 cm podłużne nacięcie skóry i otrzewnej tuż poniżej poziomu stawu biodrowego.
- Trzymając otrzewną pęsetą, należy sięgnąć w kierunku prawego biodra drugą sterylną pęsetą i wyciągnąć białą tkankę tłuszczową wraz z przytwierdzonymi jądrami.
- Jądra należy położyć na sterylnej gazie.
- Strzykawkę tuberkulinową lub Hamiltona (1 cc) należy napełnić hPSC przeznaczonymi do wstrzyknięcia. Wskazane jest uwzględnienie kontrolnej linii hPSC, o której wiadomo, że jest pluripotencjalna, np. WA09 (znanej również jako H9). W ten sposób uzyskuje się kontrolę pozytywną, która pozwala określić, czy wstrzyknięcie lub operacja zostały wykonane prawidłowo.
- hPSC (20-30 μL) należy powoli wstrzyknąć do centrum torebki jądra, z dala od dużych naczyń krwionośnych, przerywając podawanie, jeśli torebka jądra zacznie pęcznieć.
- Igłę należy wyciągać powoli, aby uniknąć refluksu komórek.
- Za pomocą pęsety należy przenieść jądra i tkankę tłuszczową z powrotem na ich pierwotne miejsce w jamie brzusznej.
- Otrzewną należy zamknąć 2 lub 3 szwami wchłanialnymi, a skórę za pomocą klipsów chirurgicznych.
- Myszy należy utrzymywać w cieple do czasu wybudzenia i podawać środek przeciwbólowy (zgodnie z wytycznymi danego wiwariuszu) po operacji dwa razy dziennie przez 1-2 dni.
Należy zauważyć, że ani środek znieczulający, ani przeciwbólowy nie zakłócają rozwoju guza. - Należy monitorować wzrost guza u zwierzęcia przez 6-12 tygodni. Bardzo rzadko guzy mogą osiągnąć rozmiar 5 mm przed upływem 6 tygodni od wstrzyknięcia, dlatego monitorowanie zwierząt jest istotne. W takim przypadku zwierzęta należy poddać eutanazji, a guzy przetworzyć i przeanalizować w rutynowy sposób.
- Gdy guz stanie się wyczuwalny w dotyku i osiągnie rozmiar około 5 mm, mysz należy znieczulić i uśmiercić zgodnie z przyjętymi protokołami postępowania ze zwierzętami.
- Należy usunąć guz i odpowiednio udokumentować: wykonać zdjęcie, zmierzyć rozmiar i zważyć.
- Guz należy pociąć na małe kawałki i utrwalić w 4% roztworze paraformaldehydu. Próbki należy przechowywać w 4% paraformaldehydzie do czasu przekazania ich patologowi w celu wykonania skrawków, barwienia i analizy.
2. Reprezentatywne wyniki:
Jeśli protokół zostanie wykonany zgodnie z opisem, a wstrzyknięta linia komórkowa jest pluripotentna, w ciągu maksymalnie 12 tygodni powinien uformować się wyczuwalny, wyraźnie widoczny guz. W przypadku uznanych linii hPSC, takich jak WA09, guzy pojawiają się zazwyczaj w ciągu 6 tygodni. W przypadku linii iPSC nie jest niezwykłe, aby guzy pojawiły się w ciągu 8–10 tygodni. Bardzo ważne jest, aby w ramach kontroli pozytywnej wstrzyknąć myszom linię o potwierdzonej pluripotentności, co pozwoli upewnić się, że procedura została przeprowadzona prawidłowo. Guzy są zazwyczaj bardzo heterogenne i posiadają wiele przylegających torbieli (Rycina 1). Analiza próbek guza wykonana przez patologa powinna wykazać tkanki zróżnicowane z wszystkich trzech listków zarodkowych (Rycina 2).
Rycina 1. Typowy potworniak pochodzący z hPSC w torebce jądra.
Zgodnie z opisanym protokołem, jeden milion komórek WA09 wstrzyknięto do torebki jądra myszy z niedoborem odporności. Po sześciu tygodniach zaobserwowano potworniaka. A) Potworniak wyjęty z myszy. B) Zbliżenie potworniaka. Zwróć uwagę na heterogenność i struktury torbielowate.
Rysunek 2. Przekroje teratoma barwione hematoksyliną i eozyną wykazują obecność tkanek z każdej z listew zarodkowych.
Po utrwaleniu teratoma poddano sekcjonowaniu oraz barwieniu hematoksyliną i eozyną. Analiza przeprowadzona przez patologa wykazała obecność komórek pochodzących z każdej z 3 listew zarodkowych.
Dyskusja
Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu stanowi wysoce niezawodny i prosty sposób generowania potworniaków z hPSC w torebce jądra. Istnieje kilka krytycznych parametrów w tej technice. W szczególności istotne jest wstrzyknięcie linii komórkowych hPSC, o których wiadomo, że są pluripotencjalne, w celu zapewnienia kontroli. Innymi ważnymi parametrami są odstępy czasowe między wstrzyknięciem a obserwacją guza. W przypadku linii komórkowych takich jak WA09 potworniaki powinny być widoczne w ciągu 6-8 tygodni. W przypadku nowych linii iPSC stwierdzamy, że często wymagane jest 10 tygodni. Kolejną kwestią jest liczba wstrzykniętych komórek. Wstrzykujemy jeden milion komórek, jednak test można z łatwością przeprowadzić przy użyciu mniejszej liczby komórek. Ponadto ważne jest medium do wstrzykiwania. Stwierdzono, że najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy komórki są wstrzykiwane w mieszaninie matrigelu i DMEM/F-12 w stosunku 1:1, w przeciwieństwie do PBS lub DMEM/F-12.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca została sfinansowana z grantów CIRM nr TR-1250, RT1-01108 oraz CL1-00502.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| DMEM/F-12 | Invitrogen | 113300-032 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
Bibliografia
- Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309, 255-255 (1984).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154(1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78, 7634-7634 (1981).
- Downing, G. J., Battey, J. F. Technical assessment of the first 20 years of research using mouse embryonic stem cell lines. Stem Cells. 22, 1168-1168 (2004).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1145 (1998).
- Reubinoff, B. E. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18, (2000).
- Muller, F. J., Goldmann, J., Loser, P., Loring, J. F. A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines. Cell Stem Cell. 6, 412-412 (2010).
- Brivanlou, A. H. Stem cells. Setting standards for human embryonic stem cells. Science. 300, 913-913 (2003).
- Lensch, M. W., Schlaeger, T. M., Zon, L. I., Daley, G. Q. Teratoma formation assays with human embryonic stem cells: a rationale for one type of human-animal chimera. Cell Stem Cell. 1, 253-25 (2007).
- Gertow, K. Organized development from human embryonic stem cells after injection into immunodeficient mice. Stem. Cells. Dev. 13, 421-421 (2004).
- Gertow, K. Isolation of human embryonic stem cell-derived teratomas for the assessment of pluripotency. Curr Protoc Stem Cell Biol. Chapter 1, Unit1B 4-Unit1B 4 (2007).
Przedruki i uprawnienia
