Generowanie potworniaków w torebce jądra

Podsumowanie

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSCs) mają potencjał do leczenia wielu różnych chorób. Użyteczność tych komórek wynika z faktu, że mogą one różnicować się w każdy typ komórek w organizmie. W niniejszym materiale opisujemy test teratomiowy, który służy do wykazania pluripotencji hPSCs.

Streszczenie

Pluripotencjalne komórki macierzyste (PSCs) charakteryzują się unikalną zdolnością do różnicowania się w komórki wszystkich trzech listków zarodkowych. Dzięki temu stanowią potencjalnie cenne narzędzie w leczeniu wielu różnych schorzeń. Wraz z pojawieniem się indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs) oraz kontynuacją badań nad ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi (hESCs), pojawiła się potrzeba opracowania testów pozwalających wykazać pluripotencję konkretnej linii komórkowej. Przenoszenie w linii zarodkowej było złotym standardem demonstrowania pluripotencji linii mysich embrionalnych komórek macierzystych (mESC)^1,2,3. Wykorzystując ten test, badacze mogą wykazać, że linia mESC jest w stanie wytworzyć wszystkie typy komórek w embrionie, w tym komórki zarodkowe⁴. Po utworzeniu ludzkich linii ESC^5,6 wybór odpowiedniego testu do potwierdzenia pluripotencji tych komórek stał się nieoczywisty, ponieważ w przypadku ludzkich ESC nie można przeprowadzić testu przenoszenia w linii zarodkowej. Jako zamiennik, w celu wykazania pluripotencji ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSCs), stosuje się obecnie test teratoma^7,8,9. Choć test ten został ostatnio poddany krytyce i aktywnie poszukiwane są nowe technologie, obecnie pozostaje on złotym standardem⁷. W tym badaniu analizowane komórki wstrzykuje się myszy z niedoborem odporności. Jeśli komórki są pluripotencjalne, z czasem rozwinie się teratoma, a w przekrojach guza będą widoczne tkanki pochodzące z trzech listków zarodkowych¹⁰. W teście teratoma hPSCs mogą być wstrzykiwane w różne obszary organizmu myszy. Do najczęstszych miejsc wstrzykiwania należą torebka jądra, torebka nerki, wątroba lub noga (podskórnie lub domięśniowo)¹¹. W niniejszej pracy opisujemy sprawdzony protokół generowania teratom z hPSCs z wykorzystaniem torebki jądra jako miejsca wzrostu guza.

Protokół

Uwaga: Wszystkie procedury z udziałem zwierząt muszą zostać zatwierdzone przez IACUC lub odpowiedni organ nadzorczy.

Wszystkie narzędzia chirurgiczne muszą zostać wysterylizowane przed operacją. Należy stosować sterylne rękawiczki, obłożenia i gazę.

1. Przygotowanie przed operacją

1. Przygotować 6-tygodniowe samce myszy Mus Musculus CbySmn.CB17-Prkdc SCID/J lub inną linię myszy z niedoborem odporności.
2. Sterylizować wszystkie narzędzia chirurgiczne, rękawiczki oraz gazę.
3. Dysocjować hPSC przeznaczone do wstrzyknięcia za pomocą accutase.
4. Policzyć komórki i zawiesić 1 000 000 komórek w 20-30 μL matrigelu rozcieńczonego 1:1 w DMEM/F-12. Przechowywać komórki w lodzie do momentu użycia.
5. Należy pamiętać, że często przydatne jest przeprowadzenie próbnego przebiegu eksperymentu z wstrzyknięciem błękitu Trypanu. Pomoże to zidentyfikować potencjalne problemy przed zmarnowaniem jakichkolwiek komórek.
6. W wariarium znieczulić mysz zgodnie z uznanymi procedurami obowiązującymi w danej instytucji. W naszych eksperymentach wykorzystano aparat do znieczulania z izofluranem. Myszy umieszczano początkowo w komorze indukcyjnej z dopływem tlenu 1 L/min i 3-4% izofluranu. Po znieczuleniu zastosowano maskę nosową z dopływem tlenu 1 L/min i 2-3% izofluranu.
7. Ogolić brzuch trymerem i oczyścić przednią ścianę brzucha myszy, zaczynając od środka i przesuwając się zgodnie z ruchem wskazówek zegara na zewnątrz. Najpierw użyć roztworu jodopowidonowego, a następnie przemyć 70% etanolem. Powtórzyć czynność 3 razy, za każdym razem zmieniając tampony. Przenieść zwierzę na podgrzewaną podkładkę, aby utrzymać jego ciepłotę wewnątrz dygestorium do hodowli tkanek lub komory sekcyjnej.
8. Wyciąć 1 cm nacięcia podłużnego przez skórę i otrzewną za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych, tuż poniżej poziomu stawu biodrowego.
9. Trzymając otrzewną pęsetą, sięgnąć drugą sterylną pęsetą w stronę prawego biodra i wyciągnąć białą tkankę tłuszczową wraz z przytwierdzonymi jądrami.
10. Położyć jądra na sterylnej gazie.
11. Napełnić strzykawkę tuberkulinową lub Hamiltona (1 cc) hPSC przeznaczonymi do wstrzyknięcia. Warto uwzględnić linię kontrolną hPSC o potwierdzonej pluripotencji, taką jak WA09 (znana również jako H9). W ten sposób uzyskuje się kontrolę pozytywną, która pozwala określić, czy wstrzyknięcie lub operacja zostały wykonane wadliwie.
12. Powoli wstrzyknąć hPSC (20-30 μL) do centrum torebki jądra, z dala od głównych naczyń krwionośnych, przerywając proces, jeśli torebka jądra zacznie puchnąć.
13. Powoli wycofać igłę, aby uniknąć refluksu komórek.
14. Za pomocą pęsety przenieść jądra i tkankę tłuszczową z powrotem na pierwotną pozycję w jamie brzusznej.
15. Zamknąć otrzewną 2 lub 3 szwami wchłanialnymi, a skórę zamknąć za pomocą zszywek chirurgicznych.
16. Mysz powinna być utrzymywana w cieple do czasu wybudzenia i otrzymać środek przeciwbólowy (zgodnie z dopuszczalnymi standardami w danym wariarium) po operacji dwa razy dziennie przez 1-2 dni.
    Należy zauważyć, że ani środek znieczulający, ani przeciwbólowy nie będą kolidować z rozwojem guza.
17. Monitorować zwierzę pod kątem wzrostu guza przez 6-12 tygodni. Bardzo rzadko guzy mogą osiągnąć wielkość 5 mm przed upływem 6 tygodni od wstrzyknięcia, dlatego ważne jest monitorowanie zwierząt. W takim przypadku zwierzęta należy poddać eutanazji, a guzy przetworzyć i przeanalizować w zwykły sposób.
18. Gdy guz stanie się wyczuwalny w dotyku i osiągnie wielkość około 5 mm, znieczulić mysz i uśmiercić ją zgodnie z przyjętymi procedurami protokołu pracy ze zwierzętami.
19. Usunąć guz i odpowiednio udokumentować – wykonać zdjęcie, zmierzyć rozmiar oraz zważyć.
20. Pokroić guz na małe kawałki i utrwalić w 4% roztworze paraformaldehydu. Przechowywać w 4% paraformaldehydzie do czasu wysłania próbek do patomorfologa w celu wykonania skrawków, barwienia i analizy.

2. Reprezentatywne wyniki:

Jeśli protokół zostanie przeprowadzony zgodnie z opisem, a wstrzyknięta linia komórkowa jest pluripotencjalna, w ciągu maksymalnie 12 tygodni powinien wytworzyć się wyczuwalny i widoczny gołym okiem nowotwór. W przypadku ugruntowanych linii hPSC, takich jak WA09, zazwyczaj obserwujemy pojawienie się nowotworów w ciągu 6 tygodni. Dla linii iPSC nie jest niezwykłe, że nowotwory pojawiają się w ciągu 8–10 tygodni. Bardzo ważne jest, aby w ramach kontroli pozytywnej wstrzyknąć myszom linię o potwierdzonej pluripotencjalności, co pozwoli upewnić się, że procedura została wykonana prawidłowo. Nowotwory zazwyczaj wyglądają bardzo heterogennie i posiadają wiele przyczepionych cyst (Rysunek 1). Analiza próbek nowotworowych wykonana przez patomorfologa powinna wykazać obecność tkanek zróżnicowanych z trzech wszystkich listków zarodkowych (Rysunek 2).

Rysunek 1. Typowy potworniaki pochodzący z hPSC w torebce jądra.

Zgodnie z opisanym protokołem, jeden milion komórek WA09 wstrzyknięto do torebki jądra myszy z niedoborem odporności. Po sześciu tygodniach zaobserwowano teratoma. A) Teratoma wyjęte z myszy. B) Zdjęcie teratoma w dużym powiększeniu. Zwróć uwagę na heterogenność i struktury torbielowate.

Rysunek 2. Przekroje teratoma barwione hematoksyliną i eozyną wykazują tkanki z każdej warstwy zarodkowej.
Po utrwaleniu teratoma wykonano przekroje i zabarwiono je hematoksyliną i eozyną. Analiza przeprowadzona przez patologa wykazała obecność komórek z każdej z 3 warstw zarodkowych.

Dyskusja

Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu stanowi wysoce niezawodny i prosty sposób generowania potworniaków z hPSC w torebce jądra. Istnieje kilka krytycznych parametrów w tej technice. W szczególności istotne jest wstrzyknięcie linii komórkowych hPSC, o których wiadomo, że są pluripotencjalne, w celu zapewnienia kontroli. Innymi ważnymi parametrami są odstępy czasowe między wstrzyknięciem a obserwacją guza. W przypadku linii komórkowych takich jak WA09 potworniaki powinny być widoczne w ciągu 6-8 tygodni. W przypadku nowych linii iPSC stwierdzamy, że często wymagane jest 10 tygodni. Kolejną kwestią jest liczba wstrzykniętych komórek. Wstrzykujemy jeden milion komórek, jednak test można z łatwością przeprowadzić przy użyciu mniejszej liczby komórek. Ponadto ważne jest medium do wstrzykiwania. Stwierdzono, że najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy komórki są wstrzykiwane w mieszaninie matrigelu i DMEM/F-12 w stosunku 1:1, w przeciwieństwie do PBS lub DMEM/F-12.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Accutase	Invitrogen	A1110501
DMEM/F-12	Invitrogen	113300-032
Matrigel	BD Biosciences	354277