Dokanałowe podawanie badanego związku do ośrodkowego układu nerwowego szczura

Streszczenie

Źródło: Chen, Y., et al. Dokanałowe dostarczanie oligonukleotydów antysensownych w ośrodkowym układzie nerwowym szczura. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film demonstruje dostarczanie badanego związku do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) przez cewnik wszczepiony w odcinek lędźwiowy kręgosłupa modelu szczurzego. Związek krąży wzdłuż płynu mózgowo-rdzeniowego do mózgu i rdzenia kręgowego, wnika do neuronów i oferuje potencjał terapeutyczny.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Operacja

1. Ze szczurem podtrzymywanym przez stożkową rurkę o pojemności 50 ml zidentyfikuj dwa naturalne doły między mięśniami nad miednicą (strzałki na rycinie 1A). Trzymając jedną ręką te doły, drugą ręką delikatnie naciśnij i poczuj kręgosłup od kierunku ogonowego do rostralnego i znajdź pierwsze główne wgłębienie między kręgami, a jest to przestrzeń międzykręgowa między kręgami krzyżowymi 1 (S1) i lędźwiowymi 6 (L6) (ryc. 1B).
2. Poruszać się lekko w kierunku rostralnym, aby zidentyfikować następne wgłębienie, przestrzeń międzykręgową między kręgami lędźwiowymi 5 (L5) i L6 oraz miejsce wstrzyknięcia (* na rysunku 1A). Za pomocą skalpela wykonać nacięcie o długości nie większej niż 2 cm w skórze wzdłuż linii środkowej od rostralnej do ogonowej, tak aby miejsce wstrzyknięcia znajdowało się w środku nacięcia (linia przerywana na rysunku 1A).
3. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby wypreparować tkankę łączną, aby uwidocznić warstwę mięśniową. Następnie wykonaj 1 cm nacięcie w torebce mięśniowej bezpośrednio po bokach grzbietowego wyrostka rdzeniowego kręgu lędźwiowego L6.
   UWAGA: W tym momencie można uwidocznić kości kręgu lędźwiowego L6.
4. Umieść zespół kaniuli prowadzącej i igły w pobliżu przedniej części 6. kręgu lędźwiowego i wepchnij go do przestrzeni międzykręgowej wzdłuż przedniej części 6. kręgu tak, aby koniec igły penetrował kanał kręgowy. Wciśnij kaniulę prowadzącą na miejsce wzdłuż igły i wyjmij igłę 23-G, pozostawiając tylko kaniulę prowadzącą na miejscu.
   UWAGA: Pomocne jest użycie kleszczyków w celu zlokalizowania wyrostka grzbietowego kręgu lędźwiowego L6 przed wkłuciem igły. Ogólnie rzecz biorąc, płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) może być widoczny w piaście igły (płyn ten może być zabarwiony nutą krwi, ale nie oznacza to, że wyrządzono szkodę lub że igła nie jest prawidłowo umieszczona). Autorzy nie zaobserwowali dużej ilości krwi ani silnego krwawienia podczas tego zabiegu. W przypadku wystąpienia któregokolwiek z nich należy skontaktować się z weterynarzem w celu ustalenia odpowiedniego leczenia i ustalenia, czy zwierzęta powinny zostać poddane eutanazji.
5. Włóż zespół drutu cewnika do kaniuli prowadzącej. Ustawić zespół drutu cewnika pod kątem około 45° do kanału kręgowego i wcisnąć koniec na około 0,3 cm do kanału kręgowego.
6. Wyjmij kaniulę prowadzącą, pozostawiając cewnik z drutem trzpieniowym na miejscu. Usuń drut stylowy około 2,5 cm od śródoponowej końcówki cewnika i wsuń cewnik do kanału kręgowego, aż oznaczenie 2 cm znajdzie się przy wejściu do kanału (widoczne tuż poniżej mięśnia), jak pokazano na rysunku 2Bvi.
   UWAGA: Wprowadzony cewnik powinien rozciągać się rostralnie do przestrzeni podpajęczynówkowej. Udane umieszczenie cewnika powinno umożliwić swobodne poruszanie się cewnika w tej przestrzeni.
7. Całkowicie wycofaj drut trzpieniowy, a płyn mózgowo-rdzeniowy może być widoczny wchodząc do wszczepionego cewnika.
8. Podłącz zespół cewnika podającego do dystalnego końca wszczepionego cewnika za pomocą końcówki igły 30 G (ryc. 2Bv, vi).
9. Załadować 60 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej do strzykawki o pojemności 100 μl (strzykawki do płukania). Załadować bolus 30 μl badanego związku (np. oligonukleotydu antysensownego lub roztworu ASO) do drugiej strzykawki (strzykawki do wstrzykiwań).
10. Podłączyć strzykawkę płuczącą (wypełnioną solą fizjologiczną) do końcówki adaptera rurki zespołu cewnika dostarczającego (Rysunek 2Bv). Wstrzyknąć 20 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej do przestrzeni dooponowej (płukanie przed wstrzyknięciem).
11. Podłączyć strzykawkę do wstrzykiwań (wypełnioną badanym związkiem) do końcówki adaptera rurki zespołu cewnika dostarczającego (Rysunek 2Bv). Wstrzyknąć 30 μl badanego związku do przestrzeni dooponowej w ciągu 30 s.
    UWAGA: Rutynowa objętość wstrzyknięcia ASO wynosi 30 μl, aby uzyskać dobre knockdown w rdzeniu kręgowym i korze mózgowej. Doniesiono, że objętości wstrzyknięć mogą wpływać na dystrybucję związku, chociaż nie badano różnych objętości wstrzyknięć. W przypadku użycia innego związku lub objętości należy empirycznie określić bezpieczeństwo i skuteczność.
12. Powtórzyć krok 1.10 i przepłukać cewnik kolejnymi 40 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej (płukanie po wstrzyknięciu). Następnie odłącz zespół cewnika podającego od wszczepionego cewnika.
    UWAGA: Uważa się, że płukanie przed i po wstrzyknięciu zmniejsza miejscową sekwestrację związków i poprawia ich dystrybucję do struktur rostralnych.
13. Aby aseptycznie przeciąć i uszczelnić wszczepiony cewnik, umieść parę sterylnych kleszczyków preparacyjnych w sterylizatorze kulkowym, aż będą bardzo gorące, a następnie zaciśnij rurkę gorącym końcem kleszczy.
    UWAGA: To działanie powoduje stopienie cewnika. W ten sposób otwór w rurze zapada się, a wszystkie boki przylegają do siebie, uszczelniając rurkę w sposób aseptyczny. Następnie umieszcza się go w przestrzeni podskórnej.
14. Użyj wchłanialnych szwów monofilamentowych, aby przymocować pozostały zgrzewany cewnik do tkanki łącznej. Następnie użyj niewchłanialnych szwów monofilamentowych, aby zamknąć skórę nad zabezpieczonym cewnikiem zgrzewanym.
    UWAGA: Klipsy do ran mogą być również używane zgodnie z protokołem instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami i ich użytkowania (IACUC). Technika ta jest kompatybilna z wielokrotnymi wstrzyknięciami, chociaż była używana tylko do jednorazowych zastrzyków w nasze ręce. Wykonalność powtarzanych wstrzyknięć powinna zostać oceniona empirycznie za zgodą IACUC.
15. Użyj gazy i soli fizjologicznej, aby zmyć krew ze skóry i pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu w podgrzewanym inkubatorze do momentu, gdy stanie się mobilne, po czym wraca do klatki domowej (dwa szczury na klatkę).
    UWAGA: Podczas wykonywania operacji na wielu szczurach tego samego dnia, wyczyść narzędzia wodą w celu usunięcia krwi i ponownie wysterylizuj za pomocą podgrzewanego suchego sterylizatora kulkowego (przez co najmniej 20 sekund, z czasem do ostygnięcia) między zwierzętami. Na każde 5 zwierząt przypada nowy zestaw instrumentów.
16. Monitoruj zwierzęta codziennie przez co najmniej 3 dni po operacji i kontynuuj monitorowanie ich co tydzień po operacji, zgodnie z protokołem IACUC.

Wyniki

Rysunek 1: Identyfikacja miejsca iniekcji i linii nacięcia. (A) Gdy brzuch szczura jest wsparty na stożkowej rurce o pojemności 50 ml, dwa wgłębienia między mięśniami powyżej miednicy są łatwo widoczne (strzałki). (B) Jedną ręką trzymając doły, drugą ręk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
rurka BD intramedic PE		Rurka polietylenowa BD PE50, średnica 0,023 cala	BD 427400 (10 stóp, Fischer Scientific 22-204008) lub 427401 (100 stóp, Fischer Scientific 14-170-12P)
Rurka PE BD intramedic		Rurka polietylenowa BD PE10, średnica 0,011 cala	BD 427410 (10 stóp, Fischer Scientific 14-170-11B) lub 4274011 (100 stóp, Fischer Scientific 14-170-12B)
Jednorazowe igły BD PrecisionGlide 30G	BD		BD
Kanula prowadząca	BD	19G x 1 WT (1,1 mm x 25 mm) Igła	BD 305186
Strzykawka Hamilton 100 ul	Firma Hamilton	Strzykawka Hamilton 100 ul
Sterylizator gorących kulek	Grzywna Science Tools		Sterylizator model nr. FST 250
Peeling powidonowy	PDI		S48050
Sól	fizjologiczna Baxter	Chlorek sodu 0,9% wlew dożylny BP 50 ml	FE1306G
Skalpel	Pióro	Skalpel jednorazowy	nr 10
Poduszka grzewcza dla małych zwierząt	K&H Nr produkcyjny		Model 1060
Drut styletyczny	McMaster-Carr	1749T14	LH-36233780
Serweta na ręcznik chirurgiczny	Dynarex		4410
Nożyczki chirurgiczne i kleszcze	FST i Fisher Scientific
Szycia	Ethicon		4-0 lub 5-0
Alternatywne źródło gotowych i sterylizowanych materiałów do tej procedury
Cewnik dozujący System	SAI Systemy		RIDC-01
Kaniula prowadząca	SAI Systemy		RIDC-GCA
Cewniki wewnętrzne	SAI Systemy		RIDC-INC
Drut styletyczny	SAI Systemy		RIDC-STY

305128 infuzyjne infuzyjne infuzyjne infuzyjne