$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Pozycjonowanie myszy
1. Oceń poziom znieczulenia za pomocą odruchu pedałowania (mocne uszczypnięcie palca u nogi), aby utrzymać płaszczyznę operacyjną.
2. Umieść urządzenie pozycjonujące w odpowiedniej odległości i na odpowiedniej wysokości, aby zapewnić wygodny dostęp do wszystkich wymaganych odczynników.
3. Gdy myszy zostaną odpowiednio znieczulone, delikatnie podnieś każdą mysz kciukiem i palcem wskazującym za kark i połóż ją na wyznaczonym krześle.
4. Na tym etapie bardzo ważne jest prawidłowe ustawienie myszki na krześle. Połóż grzbiet myszy równolegle do oparcia krzesła i pod kątem 90° do siedziska krzesła. Podnieś ręce z myszy i pozwól zwierzęciu ułożyć się naturalnie w pozycji głowy w dół i do przodu, bez pchania lub naciskania, jak pokazano na rysunku 1B. Upewnij się, że przednie kończyny myszy zapewniają naturalne wsparcie, gdy zwierzę znajduje się w tej zrelaksowanej pozycji, bez żadnego dyskomfortu dla myszy.
5. Gdy myszy są już prawidłowo ustawione, przypnij je paskiem do krzesła i natychmiast rozpocznij inokulację donosową.
2. Podawanie donosowe (IN)
UWAGA: Ten protokół opisuje dostarczanie IN kompleksów RVG9R:siRNA za pomocą urządzenia do pozycjonowania myszy. Korzystając z tego protokołu, każdej myszy można łatwo podać maksymalnie 20-30 μl roztworu w kroplach o pojemności 2 μl. Objętość ta jest mniejsza niż w jamie nosowej myszy, która wynosi 0,032cm3, więc zabieg nie powoduje śmiertelnej niedrożności nozdrzy ani uduszenia. Protokół ten pozwala na jednoczesne zaszczepienie co najmniej czterech myszy i maksymalnie ośmiu myszy na urządzenie, co skutkuje optymalizacją czasu i zmniejszoną zmiennością.
1. Weź mikropipetę 10 μL i dostosuj ją do 2 μL.
2. Załaduj do mikropipety 2 μl roztworu kompleksu RVG9R:siRNA (np. 5,2 μg siCy5 skompleksowanego ze 104 μg RVG9R do eksperymentu dostarczania i 13,5 μg siSOD1 skompleksowanego z 270 μg RVG9R do eksperymentu wyciszającego, w końcowej objętości 25 μL PBS zawierającego 5% glukozy.
3. Trzymając pipetę w dominującej ręce, dostosuj pozycję, kładąc łokieć na blacie stołu. Drugą ręką podeprzyj rękę trzymającą pipetę, aby uniknąć niekontrolowanych ruchów podczas podawania.
4. Umieść kroplę ~2 μL bardzo blisko jednego nozdrza, aby mysz mogła bezpośrednio wdychać kroplę (patrz Rysunek 1B). Jeśli niewielka kropla nie jest łatwa do uformowania, wymień końcówkę pipety na nową i powtórz operację. Użyj stopera, aby sprawdzić odstęp czasu między szczepieniami.
5. To urządzenie pozwala na leczenie co najmniej czterech myszy na raz. Jeśli inna grupa myszy musi powtórzyć krok 2.4, ustaw kolejny pasek z czterema krzesłami powyżej lub poniżej pierwszego paska z czterema krzesłami, aby pomieścić do ośmiu myszy jednocześnie na urządzeniu.
6. Powtórz krok 2.4 z drugim nozdrzem po 3-4 minutach od pierwszego zaszczepienia. Ten odstęp czasu jest wystarczający, aby mysz zakończyła inhalację pierwszej dawki i przywróciła normalne oddychanie. Jeśli kropla wdychanego roztworu zostanie usunięta z powodu przypadkowego wciągnięcia się z nosa myszy, należy ponownie dodać dodatkowe 2 μl roztworu.
7. Powtarzaj cały proces z naprzemiennymi nozdrzami, aż do zakończenia dawki 20-30 μL. Przeprowadzenie całej procedury inokulacji zajmie ~30-45 minut.
8. Nałóż mokrą maść na oczy myszy przed powrotem do wyznaczonych klatek.
UWAGA: Nie zostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej świadomości, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.
