Obrazowanie in vivo odpowiedzi neuronów zwojowych układu nerwowego za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej

Streszczenie

Źródło: Fowler, B. E., et al. Obrazowanie wapnia in vivo reakcji neuronów zwojowych przestępczych myszy na bodźce smakowe. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film demonstruje protokół dostarczania degustantów do chirurgicznie odsłoniętego zwoju kolankowatego u znieczulonej myszy i wykorzystania fluorescencji GCaMP z mikroskopią epifluorescencyjną do wizualizacji odpowiedzi neuronalnych w czasie rzeczywistym, wspomagając badania nad przetwarzaniem sygnałów smaku obwodowego.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Uruchom tastant panel
   1. Użyj ssania, aby usunąć płyn znad kolankowata. Opcjonalnie umieść punkt chłonny, aby złagodzić przesiąkanie i ułatwić nawigację mikroskopem.
   2. Umieść zwierzę na podkładce chłonnej pod mikroskopem. Zlokalizuj zwój kolankowaty: przydatne punkty orientacyjne obejmują dziurę pozostawioną w pęcherzu, dziurę w kości skroniowej i siódmy nerw. Korzystając z filtra FITC/GFP (izotiocyjanian fluoresceiny / białko zielonej fluorescencji) na zakresie epifluorescencji, sprawdź, czy nie ma poszczególnych neuronów kolankowatych z ekspresją GCaMP. Obiektyw 10x (odległość robocza 10 mm) zapewni wystarczającą rozdzielczość do śledzenia aktywności poszczególnych komórek, ale można również użyć obiektywu 20x (odległość robocza 12 mm).
   3. Umieść igłę dozującą do linii degustacyjnej mocno w pysku zwierzęcia. Umieść szalkę Petriego pod pyskiem zwierzęcia, aby złapać płyn.
   4. Upewnij się, że kamera view pole widzenia mikroskopu. Zsynchronizuj początek nagrania wideo z początkiem prezentacji degustacyjnej.
   5. Podczas nagrywania obserwuj kanał na żywo pod kątem odpowiedzi, dryfu i przesiąkania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1ml Strzykawka z zamkiem luer	Fisher Scientific	14-823-30
27 igła dozująca	Fisher Scientific	NC1372532
Punkty chłonne	Fisher Scientific	50-930-668
Acesulfam K	Fisher Scientific	A149025G
BD Tacki dla alergików z igłą przymocowaną na stałe	Fisher Scientific	14-829-6D
	FST	18200-09
Płytka stykowa	Thor Labs	MB8
Niestandardowy uchwyt na słupek głowicy	eMachineShop		Zobacz załączony plik 202410.ems
Niestandardowy metalowy słupek głowicy	eMachineShop		Zobacz załączony plik 202406.ems
Regulator temperatury DC Kamera	FHC	40-90-8D
, sCMOS OrcaFlash4 Mikroskop	Hamamatsu	C13440
Skop dysekcji	Leica	M80
LED Źródło zimnego światła	Leica Mcrosystems	KL300LED
Adaptery do węży Luer Lock 1/16"	Fisher	01-000-116
Mikroskop	Olympus	BX51WI
Mini-series Słupki optyczne	Thorlabs	MS2R
Szalki Petriego	Fisher Scientific	FB0875713A
Sprężone powietrze	Airgas	AI Z300
Samoprzylepne etykietowanie Taśma	Fisher Scientific	159015R
Silikonowa rurka zaworu zaciskowego 1/32 "x 1/16" o.d. (na stopę)	Automate Scientific	05-14
Snap25-2A-GCaMP6s-D	JAX	25111
Studenckie cienkie nożyczki	Fine Science Tools	91460-11
Sonda chirurgiczna	Roboz Surgical Store	RS-6067
Uchwyt sondy chirurgicznej	Sklep chirurgiczny Roboz	RS-6061
BD Rurki Intramedic	Fisher Scientific	22-046941
Dwustopniowy regulator gazu	Rurki	Y12FM244B580-AG
Tygon - 1/16"	Automate	Scientific 05-11
Sterownik cyfrowy/ręczny Valvelink8.2	Automate Naukowy	01-18
Valvelink8.2 System perfuzji z zaworem zaciskowym	Automate Scientific	17-pp-54
Ksylazyna	Anazyna	NADA# 139-236

Blunt Retraktory cyfrowa winylowe Airgas