Opisano metodę ekspansji limfocytów γδ T z mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC). Limfocyty γδ T pochodzące z PBMC są stymulowane i namnażane przy użyciu zoledronianu oraz interleukiny-2 (IL-2). Wielkoskalowa ekspansja limfocytów γδ T może zostać zastosowana w autologicznej immunoterapii komórkowej nowotworów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ekspansja limfocytów T $\gamma\delta$ z ludzkiej krwi obwodowej przy użyciu zoledronianu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ludzkie limfocyty γδ T potrafią rozpoznawać i reagować na szeroką gamę antygenów indukowanych stresem, wykazując tym samym wrodzoną, szeroką aktywność przeciwnowotworową i przeciwdrobnoustrojową.1 Większość limfocytów γδ T we krwi obwodowej posiada receptor TCR Vγ9Vδ2. Komórki te rozpoznają antygen w sposób niezależny od głównego układu zgodności tkankowej (MHC) i rozwijają silne funkcje efektorowe o charakterze cytolitycznym oraz typu Th1.1 W związku z tym limfocyty γδ T są atrakcyjnymi kandydatami na komórki efektorowe w immunoterapii nowotworów. Limfocyty Vγ9Vδ2 T reagują na fosfoantygeny, takie jak (E)-4-hydroksy-3-metylo-but-2-enyl pirofosforan (HMBPP), który jest syntetyzowany w bakteriach poprzez biosyntezę izoprenoidów;2 oraz izopentenyl pirofosforan (IPP), produkowany w komórkach eukariotycznych w szlaku mewalonianowym.3 W warunkach fizjologicznych generowanie IPP w komórkach nietransformowanych jest niewystarczające do aktywacji limfocytów γδ T. Rozregulowanie szlaku mewalonianowego w komórkach nowotworowych prowadzi do akumulacji IPP i aktywacji limfocytów γδ T.3 Ponieważ aminobisfosfoniany (takie jak pamidronian lub zoledronian) hamują syntazę farnezylu pirofosforanu (FPPS), enzym działający poniżej IPP w szlaku mewalonianowym, wewnątrzkomórkowe poziomy IPP oraz wrażliwość na rozpoznanie przez limfocyty γδ T mogą być terapeutycznie zwiększane za pomocą aminobisfosfonianów. Akumulacja IPP jest mniej wydajna w komórkach nietransformowanych niż w komórkach nowotworowych przy farmakologicznie istotnym stężeniu aminobisfosfonianów, co umożliwia immunoterapię nowotworów poprzez aktywację limfocytów γδ T aminobisfosfonianami.4 Co ciekawe, IPP gromadzi się w monocytach podczas traktowania PBMC aminobisfosfonianami, ze względu na wydajne pobieranie leku przez te komórki.5 Monocyty, w których gromadzi się IPP, stają się komórkami prezentującymi antygen i stymulują limfocyty Vγ9Vδ2 T we krwi obwodowej.6 W oparciu o te mechanizmy opracowaliśmy technikę wielkoskalowej ekspansji kultur limfocytów γδ T z wykorzystaniem zoledronianu i interleukiny-2 (IL-2).7 Inne metody ekspansji limfocytów γδ T wykorzystują syntetyczne fosfoantygeny: bromohydryny pirofosforan (BrHPP)8 lub 2-metylo-3-butenyl-1-pirofosforan (2M3B1PP).9 Wszystkie te metody umożliwiają ekspansję ex vivo, co pozwala na uzyskanie dużej liczby limfocytów γδ T do zastosowania w immunoterapii adoptywnej. Jednak tylko zoledronian jest odczynnikiem dostępnym komercyjnie i zatwierdzonym przez FDA. Limfocyty γδ T rozszerzone zoledronianem wykazują fenotyp pamięci efektorowej CD27-CD45RA-, a ich funkcję można ocenić za pomocą testu produkcji IFN-γ.7
Protokół
1. Izolacja PBMC
- Pobrać krew (7,5-8,0 ml) do probówki BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube z heparyną sodową. Probówka zawiera antykoagulant w postaci heparyny sodowej oraz płyn gęstościowy Ficoll-Hypaque, a także poliestrową barierę żelową, która rozdziela oba płyny. Wirować próbkę krwi w temperaturze pokojowej (18°C do 25°C) w rotorze poziomym (z koszyczkami odchylanymi) przez 20 min przy 1800 x g. Wyłączyć hamulec wirówki.
- Po wirowaniu powstają następujące warstwy (patrząc od góry do dołu): a) plazma – b) mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC) i płytki krwi – c) roztwór gęstościowy – d) żel poliestrowy – e) granulocyty – f) erytrocyty (Rys. 1).
- zebrać część warstwy plazmy, pozostawiając 5 do 10 mm plazmy nad interfazą, tak aby nie zaburzyć warstwy komórek. Plazma może zostać wykorzystana do hodowli (sekcja 2.5).
- Pobrać pipetą wzbogaconą frakcję (PBMC) z interfazy i przenieść ją do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Przepłukać PBMC za pomocą 10 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS), odwracając probówkę 5 razy, a następnie wirować przez 5 min przy 400 x g.
- Powtórzyć etapy płukania dwukrotnie, a następnie resuspender osad komórkowy w 5 ml PBS. Określić liczbę komórek. Zazwyczaj z 1 ml krwi pełnej odzyskuje się 1,3 x106 komórek.
- Określić częstość występowania i fenotyp limfocytów γδ T w PBMC za pomocą cytometrii przepływowej (sekcja 3) (Rys. 2).
2. Ekspansja limfocytów T γδ
- Wiruj zawiesiny komórkowe w 15 ml probówkach stożkowych przez 5 min przy 400 x g. g w temperaturze pokojowej, a następnie odrzucić nadsączniki.
- Przygotować pożywkę hodowlaną (CM), dodając ludzką interleukinę 2 (IL-2) oraz zoledronian (Zometa) do stężeń końcowych 1000 IU/ml i 5 μModpowiednio. ALyS203 (Cell Science & pożywki z Technology Institute lub OpTmizer (Invitrogen) wspierają dobrą ekspansję limfocytów T γδ (więcej informacji w referencjach 6 i 9). Zometa jest dostarczany w formie płynnej (fiolka 4 mg/5 ml). Aby przygotować 5 μM roztwór, dodać 50 μl Zomety do 30 ml pożywki hodowlanej.
- Resuspenduj osad komórkowy w pożywce hodowlanej i dostosuj stężenie do 1x106 komórek/ml
- Odpipetować 1 ml CM zawierającego 1x106 komórki do każdego dołka płytki 24-dołkowej. W przypadku hodowli na dużą skalę komórki można wysiać w zagęszczeniu 0,5 x 106 komórek/cm2 zależnie od powierzchni dołka płytki, szalki lub kolby.
- Dodać osocze autologiczne (rozdział 1.3), pulę surowic ludzkich grupy AB lub FCS, tak aby stanowiły one około 10% objętości hodowli (100 μl dla każdej studni płytki 24-dołkowej). Płytki należy umieścić w nawilżonej 37°C, 5% CO22 inkubator przez 24–48 h.
- Utrzymuj kulturę przy gęstości komórek wynoszącej 0,5–2 x 106 komórek/ml. Co 2-3 dni dodawać świeżą pożywkę zawierającą wyłącznie ludzką IL-2 (1000 IU/ml) (bez Zomety) i w razie potrzeby przenosić hodowane komórki do nowych dołków lub kolb, zależnie od stopnia proliferacji komórek (Ryc. 3). Do pożywki należy dodać osocze lub surowicę w taki sposób, aby stężenie surowicy utrzymało się na poziomie co najmniej 1%.
- Zebrać komórki w 12. lub 14. dniu i określić częstość występowania, fenotyp oraz funkcje limfocytów γδ T za pomocą cytometrii przepływowej (patrz poniżej).
3. Analiza fenotypowa metodą cytometrii przepływowej
- Przenieś 200 μl próbek zawierających 2 x 105 komórek do probówek do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS).
- Dodaj 2 ml zimnego PBS i wiruj przez 5 min przy 400 x g. Następnie resuspenduj osady w 50 μl buforu FACS (PBS + 1% FCS + 0,1% azotku sodu). Do próbek dodaj po 5 μl każdego z przeciwciał (przeciwciała monoklonalne wymieniono w Tabeli 1).
- Inkubuj w ciemności na lodzie przez 20 min.
- Do każdej próbki dodaj 2 ml buforu FACS, a następnie wymieszaj w wortexie. Wirować próbki przez 5 min przy 400 x g w temperaturze 4°C. Ostrożnie odlej nadsącz.
- Resuspenduj komórki w 300 μl buforu FACS i wymieszaj w wortexie. Próbki przeanalizuj za pomocą cytometru przepływowego (Rys. 2).
4. Test produkcji IFN-γ10
- Dzień przed analizą przygotować komórki stymulujące, hodując przez noc 3-5 x105 komórek Daudi/ml w pożywce RPMI 1640 z dodatkiem 10% FCS (RPMI-10) oraz Zomety (5 μM) (dalej określanych jako Z-Daudi).
- Zebrać komórki Z-Daudi i resuspender w RPMI-10 do stężenia 2x106 komórek/ml. Do każdego dołka płytki 96-dołkowej o okrągłym dnie dodać 100 μl komórek Z-Daudi (2x105).
- Przygotować limfocyty γδ T w stężeniu 2x106 komórek/ml w RPMI-10 zawierającym Brefeldynę A w stężeniu 20 μg/ml. Przenieść 100 μl zawiesiny limfocytów γδ T (2x105) do każdego dołka zawierającego komórki Z-Daudi lub do dołków kontrolnych (100 μl samego RPMI-10 lub RPMI-10 z 20 ng/ml mirystynianu 12 i octanu 13 forbolu [PMA] oraz 2 μg/ml jonomycyny).
- Wymieszać, pipetując zawiesinę kilkakrotnie w górę i w dół. Inkubować przez 4 hr w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2.
- Wirować płytkę przez 5 min przy 400 x g w temperaturze 4°C, a następnie resuspender osady w 200 μl zimnego PBS.
- Przenieść próbki do probówek do FACS. Dodać 4 ml zimnego PBS i wirować probówki przez 5 min przy 400 x g w temperaturze 4°C.
- Resuspender osady w 50 μl buforu FACS z przeciwciałem anty-TCRVγ9 sprzężonym z FITC (5 μl) oraz przeciwciałem mAb anty-CD3 sprzężonym z PE/Cy5 (2,5 μl). Inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
- Dodać 100 μl odczynnika 1 IntraPrep i inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej. Do każdej probówki dodać 4 ml PBS i wirować przez 5 min przy 400 x g w temperaturze pokojowej.
- Usunąć nadsącz poprzez aspirację i dodać 100 μl odczynnika 2 IntraPrep. Inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej bez wytrząsania.
- Do probówki z badaniem dodać 5 μl przeciwciała mAb anty-IFN-γ sprzężonego z PE. Inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
- Do każdej probówki dodać 4 ml PBS i wirować przez 5 min przy 400 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć nadsącz poprzez aspirację i resuspender osad komórkowy w 0,5 ml buforu FACS.
- Przeanalizować komórki za pomocą cytometru przepływowego. Wyznaczyć bramkę dla komórek CD3+ TCRVγ9+ i zbadać ekspresję IFN-γ (Rys. 4).
5. Reprezentatywne wyniki:
Ważne jest określenie procentowego udziału limfocytów γδ T w PBMC w momencie rozpoczynania hodowli. Jak pokazano na Ryc. 2 A, odsetek limfocytów γδ T CD3+TCRVγ9+ w PBMC wynosił 1,6% w dniu 0. Dominującymi populacjami były fenotypy naiwne CD27+CD45RA+ lub fenotypy pamięci centralnej CD27+CD45RA-. Po efektywnej stymulacji limfocyty γδ T tworzyły klastry w dniach 3–5 (Ryc. 3 A i B). W przypadku opóźnienia tworzenia klastrów, wzrost innych typów komórek, takich jak limfocyty αβ T CD4+ lub CD8+ albo komórki NK, mógł zdominować wzrost limfocytów γδ T (Ryc. 3 C i D). Po 14 dniach hodowli, w udanych hodowlach limfocytów γδ T, ich częstość wzrosła do ponad 93,8% hodowanych komórek (Ryc. 2 E). Hodowane limfocyty γδ T wykazały zwiększoną ekspresję NKG2D i CD69 (Ryc. 2 G i H). Prezentowały one fenotyp pamięci efektorowej CD27-CD45RA- (Ryc. 2 F). Funkcje limfocytów γδ T oceniano pod kątem produkcji cytokin i cytotoksyczności. Barwienie wewnątrzkomórkowe IFN-γ wykazało, że limfocyty γδ T produkowały IFN-γ w odpowiedzi na traktowanie PMA/ionomycyną lub w kontakcie z komórkami Z-Daudi, w których po traktowaniu zoledronianem nagromadził się IPP (Ryc. 4). Wyniki te wskazują, że zoledronian może efektywnie stymulować i powiększać pulę funkcjonalnych limfocytów γδ T.
| probówka | FITC | PE | ECD | PE/Cy5 |
| 1 | CD3 | CD19 | CD45 | CD14 |
| 2 | CD3 | TCRαβ | CD4 | CD8 |
| 3 | CD3 | CD56 | ||
| 4 | TCR Vγ9 | TCRαβ | CD45 | CD3 |
| 5 | TCR Vγ9 | NKG2D | ||
| 6 | TCR Vγ9 | CD69 | ||
| 7 | TCR Vγ9 | mysie IgG1 | ||
| 8 | TCR Vγ9 | CD45RA | CD27 | |
| 9 | TCR Vγ9 | mysi IgG1 | mysi IgG1 |
Tabela 1. Przeciwciała monoklonalne użyte do wielobarwnego barwienia limfocytów γδ T. Przykład analizy fenotypowej limfocytów γδ T przeprowadzonej w naszym laboratorium przedstawiono na Rys. 2.
Rycina 1. Separacja PBMC. Krew (7,5-8,0 ml) pobiera się do probówki BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube z heparyną sodową i bezpośrednio wiruje przez 20 min przy 1800 × g. Po wirowaniu powstają następujące warstwy (licząc od góry): a) osocze – b) PBMC i płytki krwi – c) roztwór gęstościowy – d) żel poliestrowy – e) granulocyty – f) erytrocyty.
Rycina 2. Typowy fenotyp powierzchniowy limfocytów γδ T. PBMC stymulowano zoledronianem i IL-2 przez 14 dni. Komórki barwiono przeciwciałami anty-TCR Vγ9 znakowanymi FITC oraz anty-CD3 znakowanymi PE/Cy5 w celu monitorowania ekspansji limfocytów γδ T (A i E). Limfocyty γδ T zidentyfikowano na podstawie ekspresji TCRVγ9, a następnie badano ich ekspresję CD27 i CD45RA (B i F), NKG2D (C i G) lub CD69 (D i H).
Rysunek 3. Reprezentatywne hodowle limfocytów γδ T. PBMC stymulowano IL-2 (1000 IU/ml) i zoledronianem (5 μM). Przedstawiono reprezentatywne pola widzenia (odwrócony mikroskop IX71 [Olympus] x 200). W 3. dniu (A) oraz 5. dniu (B) można zaobserwować klastry i agregaty limfocytów γδ T, co świadczy o ich pomyślnej ekspansji. W przeciwieństwie do tego, nie zaobserwowano klastrów ani agregatów w przypadkach, gdy wzrost limfocytów γδ T był niewystarczający (C i D).
Rysunek 4. Produkcja IFN-γ. Komórki T γδ inkubowano przez 4 hr tylko z RPMI-10 (A), z PMA/ionomycin (B) lub z Z-Daudi (C). Najpierw zabarwiono ekspresję powierzchniową TCRVγ9, a następnie zbadano produkcję IFN-γ za pomocą wewnątrzkomórkowego barwienia IFN-γ.
Rycina 5. Kinetyka hodowli komórek γδ T. (A) Bezwzględna liczba hodowanych komórek, (B) procent komórek γδ T oraz (C) bezwzględna liczba komórek γδ T w wskazanych punktach czasowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj metoda umożliwia efektywną ekspansję limfocytów T γδ z PBMC. Limfocyty T γδ aktywowane i namnażane za pomocą zoledronianu oraz IL-2 wykształcają pełne funkcje efektorowe, co odzwierciedla produkcja cytokin oraz cytotoksyczność. Doniesiono, że syntetyczne fosfoantygeny: bromohydryny pirofosforan (BrHPP) oraz 2-metylo-3-butenylo-1-pirofosforan (2M3B1PP) również indukują ekspansję limfocytów T γδ; nie są one jednak dostępne komercyjnie. Z kolei zoledronian posiada już licencję do zastosowań klinicznych p...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ZOMETA | Novartis AG | zoledronian | |
| PROLEUKIN | Novartis AG | rekombinowana ludzka IL-2 | |
| Probówka do przygotowania komórek BD Vacutainer CPT z heparyną sodową | BD Biosciences | 362753 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| pożywka ALyS203 | Cell Science & Technology Institute | 0301-7 | |
| OpTmizer | Invitrogen | 0080022SA | |
| brefeldyna A | Sigma-Aldrich | B5936-200UL | |
| fosforan 12-mirystynianu 13-octanu (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | |
| ionomycyna | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | |
| IntraPrep | Beckman Coulter Inc. | A07803 | |
| przeciwciało anty-ludzkie CD3-FITC lub PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07746 FITC A07749 PE/Cy5 | |
| przeciwciało anty-ludzkie CD4-ECD | Beckman Coulter Inc. | 6604727 | |
| przeciwciało anty-ludzkie CD8-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | 6607011 | |
| przeciwciało anty-ludzkie CD14-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07765 | |
| przeciwciało anty-ludzkie CD19-PE | Beckman Coulter Inc. | A07769 | |
| przeciwciało anty-ludzkie CD45-ECD | Beckman Coulter Inc. | A07784 | |
| przeciwciało anty-ludzkie CD56-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07789 | |
| przeciwciało anty-ludzkie TCRαβ-PE | Beckman Coulter Inc. | A39499 | |
| przeciwciało anty-ludzkie TCR Vγ9-FITC | Beckman Coulter Inc. | IM1463 | |
| przeciwciało anty-ludzkie CD27-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | 6607107 | |
| przeciwciało anty-ludzkie CD45RA-ECD | Beckman Coulter Inc. | IM2711 | |
| przeciwciało anty-ludzkie CD69-PE | BD Biosciences | 555531 | |
| przeciwciało anty-ludzkie NKG2D-PE | Beckman Coulter Inc. | A08934 | |
| przeciwciało anty-ludzkie IFNγ-PE | Beckman Coulter Inc. | IM2717U | |
| kontrolny przeciwciało izotypowe mysie IgG1-PE | Beckman Coulter Inc. | A07796 | |
| kontrolny przeciwciało izotypowe mysie IgG1-ECD lub PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07797A07798 |
Bibliografia
- Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity. Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).
- Hintz, M. Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli. FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).
- Gober, H. J. Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells. J Exp Med. 197, 163-168 (2003).
- Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology. Cancer Res. 67, 5-8 (2007).
- Roelofs, A. J. Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP. Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).
- Dieli, F. Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo. Blood. 102, 2310-2311 (2003).
- Kondo, M. Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy. Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).
- Espinosa, E. Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells. J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).
- Kobayashi, H. Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study. Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).
- Murali-Krishna, K. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8, 177-187 (1998).
- Sato, K. Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy. Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).
- Abe, Y. Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma. Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).
- Nakajima, J. A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells. Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
