Wstrzyknięcie wektora wirusowego do rdzenia kręgowego szczura w celu wstecznego śledzenia neuronów

Streszczenie

Źródło: Keefe, KM i wsp. Bezpośrednie wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego uwypukla wiele ścieżek motorycznych w rdzeniu kręgowym szczura. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film pokazuje wstrzyknięcie wysoce wydajnego wektora wirusowego transportu wstecznego (HiRet) do rdzenia kręgowego szczura w celu śledzenia ścieżek neuronalnych. Wirus ma glikoproteiny do wnikania synaptycznego i gen kodujący białka fluorescencyjne. Igłę wprowadza się do rdzenia kręgowego, a zawiesinę wirusa podaje się w kontrolowanej dawce. Igła jest ostatecznie usuwana po pozostawieniu wystarczającej ilości czasu na dyfuzję wirusa.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowania przedoperacyjne

1. Na kilka dni przed zabiegiem należy przygotować wyciągnięte szklane igły do wstrzyknięcia wirusa za pomocą szklanych pipet kapilarnych o pojemności 3,5 nanolitra przeznaczonych do iniekcji nanolitrowych. Pociągnij każdą pipetę na dwustopniowym ściągaczu igłowym zgodnie z instrukcjami producenta, aby utworzyć szablony dwuigłowe.
2. Udoskonal końcówkę szablonów igieł, odcinając około 1-2 mm nadmiaru szkła mikronożyczkami. Zmierz przybliżoną wielkość apertury pod mikroskopem za pomocą szkiełka kalibracyjnego mikroskopu, aby wyizolować igły o aperturze 30-40 μm.
3. Gdy igła jest ustawiona pod kątem 30°, użyj ukosowania mikropipet, aby utworzyć końcówkę o aperturze 30-40 μm i kącie ukosu 45°. Sprawdź szerokość przysłony za pomocą skali noniusza na szkiełku kalibracyjnym. Przepuścić wodę i etanol przez szklaną igłę za pomocą strzykawki z elastyczną nasadką do igły, aby zmyć zanieczyszczenia i oznaczyć igłę w regularnych odstępach czarnym markerem.
4. Umieść igły na przykrytej szalce Petriego, uprzednio oczyszczonej 70% etanolem i sterylizuj przez 30 minut w kapturze bezpieczeństwa biologicznego w świetle ultrafioletowym lub UV.
5. Przygotować wysoce wydajny lentiwirus do transportu wstecznego (HiRet), usuwając odpowiednią objętość z zamrażarki bezpośrednio przed zabiegiem.
   UWAGA: Odpowiednia objętość obejmuje ilość potrzebną do wstrzyknięcia (1 μl na wstrzyknięcie x liczba wstrzyknięć) plus niewielką ilość dodatkowej objętości uwzględniającą straty związane z pipetowaniem i ładowaniem. Wirus należy transportować i przechowywać na lodzie, gdy nie jest używany.
6. Przygotuj wtryskiwacz, podłączając go do mikropompy i umieszczając w mikromanipulatorze ze skalą noniuszową.
7. Aby przygotować szklaną igłę, ostrożnie załaduj kolorowy barwnik, taki jak czerwony olej, za pomocą strzykawki wyposażonej w elastyczną igłę. Upewnij się, że w igle nie pozostały żadne pęcherzyki. Podczas obchodzenia się z igłą należy stosować technikę aseptyczną i powstrzymać się od dotykania końcówki.
8. Włóż szklaną igłę do wtryskiwacza, upewniając się, że igła jest prawidłowo osadzona w podkładkach, nasadka wtryskiwacza jest mocno dokręcona, a stalowa igła wtryskiwacza jest przedłużona o około 3/4 długości szklanej igły. Wirusy mogą zostać załadowane do igły w późniejszym kroku.

2. Znieczulenie i przygotowanie pola operacyjnego

1. Zważ zwierzę na wadze cyfrowej. Zapisz masę ciała przed operacją, aby określić wymaganą objętość środka znieczulającego i umożliwić monitorowanie masy ciała po operacji. W tym protokole wykorzystano samice szczurów Sprague-Dawley, około 200–250 g.
2. Znieczulić szczura za pomocą inhalacji izofluranu lub wstrzykniętego roztworu ketaminy/ksylazyny (k/x). W tym przypadku ketamina jest wstrzykiwana dootrzewnowo w dawce 67 mg/kg, a ksylazyna w dawce 6,7 mg/kg.
3. Potwierdź odpowiednią płaszczyznę znieczulenia, mocno ściskając stopę. Jeśli nastąpi odruchowe wycofanie, odczekaj kilka dodatkowych minut przed kontynuowaniem.
   UWAGA: Obserwuj również wąsy, oczy i częstość oddechów pod kątem oznak przytomności. Jeśli wąsy drgają, oko mruga przy delikatnym dotyku lub oddech jest szybki i płytki, poczekaj, aż płaszczyzna znieczulenia znajdzie się głębiej, aby kontynuować protokół. Należy również monitorować te objawy przez cały czas laminektomii i operacji iniekcji. Jeśli zwierzę wykazuje płytką płaszczyznę znieczulania, podaj zastrzyk przypominający z ketaminy równej 1/2 pierwotnej dawki k/x.
4. Ogol szczura wzdłuż grzbietowej linii środkowej od bioder do dolnego kąta łopatek. Napnij skórę zwierzęcia, aby uzyskać łatwiejsze i bardziej precyzyjne golenie.
5. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy.
6. Nałóż środek antyseptyczny na ogolony obszar, aby wysterylizować miejsce. Do pierwszego peelingu nasącz sterylną gazę 5% roztworem jodu i zetrzyj wszystkie włosy i zanieczyszczenia. Następnie wykonaj jednokierunkowe machnięcie sterylną gazą nasączoną 70% etanolem, aby żaden obszar nie stykał się dwukrotnie. Użyj tej samej techniki z naprzemiennym jodem i gazą nasączoną etanolem jeszcze dwa razy.

3. Pole operacyjne i przygotowanie narzędzi

1. Przygotuj zestaw autoklawowanych narzędzi chirurgicznych, który zawiera skalpel, rongeurs, kleszczyki do zębów szczurów, nożyczki sprężynowe, hemostatyki, średniopunktowe zakrzywione kleszcze i zwijacze lub obciążone haki, rozwijając sterylną folię, aby stworzyć sterylne pole.
2. Otwórz opakowanie sterylnych rękawic chirurgicznych i połóż sterylną folię na rękawiczki na stole. Użyj tego jako dodatkowego sterylnego pola dla używanych narzędzi, aby zapobiec zanieczyszczeniu sterylnej folii.
3. Upuść ostrze skalpela #10 na sterylne pole. Przymocuj ostrze do uchwytu za pomocą hemostatów. W dostępnym miejscu umieść sterylną sól fizjologiczną, chromowy szew katgutowy 4.0 oraz materiały do tamowania krwawienia, takie jak kauteryzator, sterylna gaza, sterylne aplikatory z bawełnianą końcówką (w przypadku krwawień mięśniowych) lub pianka żelowa lub wosk kostny (w przypadku krwawień kostnych).
4. Weź zwierzę i połóż je na sterylnej szmatce. Umieść gazę pod pęcherzem, aby zebrać mocz. Podeprzyj obszar docelowy zwiniętym ręcznikiem pod brzuchem. Jeśli to możliwe, umieść chirurgiczną poduszkę grzewczą pod sterylną szmatką, szczególnie w przypadku dłuższych zabiegów.
   UWAGA: Sterylność jest ważna podczas operacji przetrwania. Miej pod ręką butelkę z rozpylaczem zawierającą 70% etanol, aby utrzymać sterylność rąk w rękawiczkach, oraz sterylizator kulkowy, jeśli sterylność narzędzi jest zagrożona lub między poszczególnymi operacjami.

4. Odsłonięcie kręgosłupa i identyfikacja miejsca laminektomii

1. Zidentyfikuj obszar, w którym zostanie wykonane nacięcie skóry, delikatnie naciskając palcami ostatnie żebro, aby zlokalizować Lumber lub kręg L1. Używając tego jako punktu orientacyjnego, wykonaj 3-4 cm nacięcie skóry za pomocą skalpela chirurgicznego #10 kończącego się nieco poniżej L1, aby odsłonić mięsień. Utrzymuj skórę napiętą, delikatnie rozprowadzając i mocno dociskając ostrzem skalpela, aby zapewnić czyste nacięcie.
2. W razie potrzeby wytnij i rozprowadź powierzchowny tłuszcz za pomocą kleszczy i nożyczek. (W zależności od kręgu docelowego, może, ale nie musi, występować duża poduszeczka tłuszczowa powierzchowna w stosunku do mięśnia).
3. Wyczuj wyrostki kolczyste płaską częścią ostrza skalpela lub palcem. Często obszar linii środkowej będzie obrysowany literą "V" białej powięzi po obu stronach. Wykonaj małe cięcie rostralne, aby zapewnić miejsce na bezpieczne uchwycenie górnego wyrostka za pomocą kleszczy do zębów szczura, a następnie wykonaj dwa długie, głębokie nacięcia jak najbliżej wyrostków. W najgłębszym miejscu nacięcia można wyczuć ostrzem skalpela grzbietową powierzchnię kręgów.
4. Trzymaj mięśnie boczne na bok za pomocą zwijaczy lub obciążonych haków, aby poprawić widoczność. Oczyść mięśnie wokół procesów za pomocą skalpela, nożyczek sprężynowych lub rongeurów, aby określić kształt ich głów.
   UWAGA: Pamiętaj, że rdzeń kręgowy nie rozciąga się na całą długość kręgosłupa, ponieważ tkanka rdzenia kręgowego przestaje rosnąć wcześniej w rozwoju niż kość. Oznacza to, że docelowy poziom kręgosłupa może znajdować się pod inaczej nazwanym kręgiem.
5. Zlokalizuj klatkę piersiową lub T11 i przylegające do nich procesy T12 i T13.
   UWAGA: Pomoc w celowaniu w prawidłowe poziomy kręgów można znaleźć w atlasie rdzenia kręgowego szczura i wcześniejszych badaniach przedstawiających punkty orientacyjne u myszy, która ma bardzo podobną strukturę kręgów6,33. Pozostaw niezakłócony wyrostek kolczysty rostralny, taki jak T9, aby uzyskać punkt orientacyjny w linii środkowej.

5. Wykonanie laminektomii

1. Po prawidłowym zidentyfikowaniu obszaru docelowego należy wykonać laminektomię grzbietowych aspektów T11-T13. Delikatnie rozłóż kręgi, aby odsłonić więzadła międzykręgowe, które są dobrymi miejscami do wprowadzenia rongeurs do początkowego ugryzienia kości. Trzymaj rongeurs w pozycji półzamkniętej, aby zwiększyć precyzyjną kontrolę.
2. Usuń wyrostki kolczyste i grzbietową część kręgów, biorąc małe kęsy rongeurs. Uważaj, aby nie uszkodzić rdzenia kręgowego ani nie naruszyć opony twardej. Lekko podnieś kleszcze do zębów szczura, aby pomóc odciągnąć rdzeń kręgowy od kręgów i zmniejszyć skłonność do uderzania w tkankę rdzenia kręgowego.
3. Oczyść kość z dala od linii środkowej, aby można było zaobserwować naczynie krwionośne w linii środkowej. Zostaw okno, które wyraźnie pokazuje tkankę rdzenia kręgowego i jest wolne od zanieczyszczeń.
4. Delikatnie dotknij rdzenia kręgowego kleszczami. Niektóre zwierzęta mogą odruchowo skakać, nawet jeśli ich płaszczyzna znieczulenia jest głęboka. Nałóż kilka kropli środka znieczulającego, takiego jak lidokaina, bezpośrednio na rdzeń kręgowy, aby zapobiec skakaniu podczas zabiegu wstrzykiwania.
5. Zabezpiecz zwierzę w uchwycie kręgosłupa, mocując kleszcze stabilizujące do wyrostków kolczystych, rostralne i ogonowe do okna laminektomii. Podnieś brzuch zwierzęcia za pomocą uchwytu kręgosłupa, aby zniwelować efekt ruchów oddechowych. Zwiększy to stabilność igły i zapewni odpowiednią głębokość wstrzyknięcia.

6. Ładowanie wirusa i ustawianie iniektora

1. Załaduj wirusa do wstrzykiwacza, pipetując około 5 μl na kawałek parafilmu i ustawiając igłę tak, aby końcówka znajdowała się wewnątrz kropli.
2. Za pomocą mikropompy należy pobrać do 4 μl wirusa z szybkością 20–100 nL/s.
3. Ustawić kontroler tak, aby wstrzykiwał i uwalniał niewielką ilość wirusa z igły, aby upewnić się, że końcówka igły nie jest zablokowana. Zetrzyj nadmiar wirusa chusteczką laboratoryjną.
   UWAGA: Strzykawka Hamilton ze stalową igłą może być używana jako alternatywa dla pipet z wyciąganego szkła.
4. Ustaw mikromanipulator tak, aby łuska noniusza była widoczna, a igłę umieść na linii środkowej rdzenia kręgowego.
   UWAGA: Linia środkowa może być czasami zlokalizowana przez duże naczynie krwionośne biegnące po przedniej powierzchni rdzenia kręgowego. Może się to jednak różnić u poszczególnych szczurów, a celowanie w linię środkową powinno być potwierdzone przez porównanie z nienaruszonym wyrostkiem kolczystym.
5. Skierować igłę w bok na 0,8 mm za pomocą skali noniusza na mikromanipulatorze.
6. Opuść igłę do rdzenia kręgowego, aż wbije się, ale nie przebije opony twardej. Szybkim ruchem skręcającym nakłuj oponę twardą igłą, aż zapadnie się na głębokość 1,5 mm.

7. Wstrzykiwanie wirusa do rdzenia kręgowego

1. Po umieszczeniu igły na miejscu zaprogramuj wstrzykiwacz tak, aby wstrzykiwał z szybkością 400 nL/min. Upewnij się, że wirus dostaje się do rdzenia kręgowego, obserwując postęp frontu barwnika. Nie powinno być widocznego wycieku ani wybrzuszenia tkanki rdzenia kręgowego. W przypadku zaobserwowania nieszczelności można ją czasami złagodzić, zmniejszając prędkość wtrysku do 200 nL/min.
2. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy pozostawić igłę w rdzeniu kręgowym na 2–5 minut (w zależności od wstrzykniętej objętości), aby ułatwić dyfuzję wirusa.
3. Powoli wyjąć igłę i przejść do następnego miejsca wstrzyknięcia. Wstrzyknąć 1 μl wirusa do każdego z 6 równomiernie rozmieszczonych miejsc oddalonych od siebie o około 1 mm wzdłuż długości tkanki rdzeniowej L1-L4. Ta sama igła może być używana do każdego wstrzyknięcia, o ile działa prawidłowo.

8. Zamykanie ran i opieka pooperacyjna

1. Wyjmij zwierzę z uchwytu kręgosłupa i wyjmij zwijacze lub haki służące do rozsuwania mięśni bocznych. Przed zamknięciem upewnij się, że rana jest wolna od wszelkich zanieczyszczeń.
2. Zszyj mięsień za pomocą chromowego szwu katgutowego 4,0. Odetnij nici szwów blisko węzła, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wewnętrznego podrażnienia skóry.
3. Zszyj skórę za pomocą spinek do ran o średnicy 9 mm. Aby umożliwić optymalne gojenie, wyrównaj krawędzie skóry przed zszyciem.
4. Umieść zwierzę na podkładce grzewczej konwekcyjnej i monitoruj, aż się obudzi.
5. Wstrzyknij podskórnie 5-10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aby uzupełnić płyny i antybiotyk, taki jak cefazolina, aby zapobiec infekcji. Kiedy zwierzę jest w stanie chodzić, umieść je z powrotem w klatce domowej i podaj początkowe środki przeciwbólowe. Monitoruj szczury pod kątem wszelkich oznak bólu i niepokoju oraz traktuj je zgodnie z zatwierdzoną przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami i użytkowania zwierząt (IACUC) procedurą łagodzenia bólu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
#10 Ostrza skalpela	Roboz	RS-9801-10	Do użytku ze skalpelem.
Strzykawki 1 ml	Becton, Dickinson and Company	309659	Do znieczulającego wstrzykiwania IP, potencjalnych zastrzyków przypominających znieczulanie i zastrzyków z antybiotykiem.
Strzykawki 10 ml	Becton, Dickinson and Company	309604	Do wstrzykiwania soli fizjologicznej zwierzęciu, po operacji.
4.0 Chromowy szew katgutowy	DemeTECH	NN374-16	Do ponownego wiązania mięśni podczas zamykania.
48000 Beveler do mikropipet	World Precision Instruments	32416	Służy do ukosowania końcówek ciągniętych szklanych rurek kapilarnych w celu utworzenia funkcjonalnych szklanych igieł.
5% roztwór jodu Purdue	Products L.P.	L01020-08	Do stosowania w sterylizacji pola operacyjnego.
70% Etanol	N/A	N/A	Do sterylizacji nowo przygotowanych igieł szklanych, modeli zwierzęcych podczas przygotowania chirurgicznego i rąk chirurga podczas operacji, a także wszystkich innych drobnych czynności związanych z utrzymaniem sterylności.
Środek znieczulający (roztwór ketaminy/ksylazyny)	Zoetis	240048	Do utrzymywania zwierzęcia w prawidłowej płaszczyźnie świadomości podczas operacji.
Antybiotyk (Cefazolin)	West-Ward Pharmaceuticals	NPC 0143-9924-90	Do wstrzykiwania podskórnego w celu zapobiegania infekcji po operacji.
Sterylizator koralików	CellPoint	5-1450	Do sterylizacji na gorąco narzędzi chirurgicznych.
Bonewax	Fine Science Tools	19009-00	Do uszczelniania kości w przypadku krwawienia z kości.
Cauterizer	Fine Science Tools	18010-00	Do uszczelniania wszelkich tętnic lub żył przerwanych podczas operacji, aby zapobiec nadmiernej utracie krwi.
Waga cyfrowa	Okaus	REV.005	Do ważenia zwierzęcia podczas przygotowania chirurgicznego.
Elastyczna nasadka do igieł	World Precision Instruments	MF34G-5	Do czyszczenia szklanych igieł i ładowania czerwonego oleju do szklanych igieł.
Gelfoam	Pfizer	H68079	Do uszczelniania kości w przypadku krwawienia z kości.
Szklane rurki kapilarne	World Precision Instruments	4878	Do ciągniętych szklanych igieł - powinny być przeznaczone do wtryskiwaczy nanolitrowych.
Maszynka do strzyżenia włosów	Oster	111038-060-000	Do oczyszczania miejsca operowanego z włosów.
Hemostats	Roboz	RS-7231	Do ogólnego użytku w chirurgii.
Chusteczki	Kimtech Kimtech	34155	Do ogólnego stosowania w chirurgii.
Kleszczyki zakrzywione średniego punktu	Roboz	RS-5136	Do ogólnego użytku w chirurgii.
Mikromanipulator ze skalą noniuszową	Kanetec	N/A	Do precyzyjnego celowania podczas operacji.
Mikronożyczki	Roboz	RS-5621	Do wycinania szklanych szeptów ze świeżo wyciągniętych szklanych rurek kapilarnych.
Mikroskop ze skalą światła i noniusza Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	Służy do wizualizacji i pomiaru ukosowania ciągniętych szklanych rurek kapilarnych w funkcjonalne szklane igły.
Sterownik pompy mikrostrzykawkowej	World Precision Instruments	62403	Do kontrolowania szybkości wtrysku.
Nanolitr 2000 Pompa Head Injector	World Precision Instruments	500150	Do ładowania i wstrzykiwania wirusa w kontrolowany sposób.
Ściągacz igieł	Narishige	PC-100	Do podgrzewania i rozsuwania szklanych kapilar w celu uformowania szklanych igieł.
Maść oftalamowa	Dechra Veterinary Products	RAC 0119	W celu ochrony oczu zwierzęcia podczas operacji.
Parafilm	Bemis	PM-996	Aby pomóc w ładowaniu wirusa do nanowtryskiwacza.
Igły PrecisionGlide (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	Do stosowania ze strzykawkami 1 ml i 10 ml, aby umożliwić wstrzyknięcie modelu zwierzęcego.
Kleszczyki do zębów szczurów	Roboz	RS-5152	Do chwytania wyrostków kolczystych.
Red Oil	N/A	N/A	Aby zapewnić front do wizualizacji wirusa wnikającego do tkanki podczas wstrzyknięcia.
Retraktory	Roboz	RS-6510	Do utrzymywania otwartej rany pooperacyjnej.
Rimadyl Tablets	Bio Serv	MP275-050	Do leczenia bólu po operacji.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	Do usuwania mięśni z kręgosłupa podczas operacji.
Rękojeść ostrza skalpela	Roboz	RS-9843	Do rozcinania skóry i poduszeczki tłuszczowej modelu zwierzęcego podczas operacji.
Nożyczki	Roboz	RS-5980	Do ogólnego użytku w chirurgii.
Klipsy do ran ze stali nierdzewnej	CellPoint	201-1000	Do wiązania skóry rany chirurgicznej podczas zamykania.
Kleszcze do usuwania zszywek	Kent Scientific INS750347		Aby usunąć zszywki, jeśli zostały nałożone nieprawidłowo.
Sterylna tkanina	Phenix Research Products	BP-989	Aby zapewnić sterylną powierzchnię do operacji.
Sterylne aplikatory z bawełnianą końcówką	Puritan	806-WC	Do wchłaniania krwi w ranie pooperacyjnej przy jednoczesnym zachowaniu sterylności.
Sterylna gaza	Covidien	2146	Do czyszczenia obszaru operacyjnego i narzędzi chirurgicznych przy zachowaniu sterylności.
Sterylna sól fizjologiczna	Baxter Healthcare Corporation	281324	Do stosowania w oczyszczaniu krwi i do uzupełniania płynów po operacji.
Rękawice chirurgiczne	N/A	N/A	Do użytku przez chirurga w celu utrzymania sterylnego pola podczas operacji.
Chirurgiczna poduszka grzewcza	N/A	N/A	Do utrzymywania temperatury ciała modelu zwierzęcego podczas operacji.
Mikroskop chirurgiczny	N/A	N/A	Dla lepszej wizualizacji rany pooperacyjnej.
Zszywacz chirurgiczny	Kent Scientific	INS750546	Do nakładania zszywek.
T / Pump Pompa wodna do terapii cieplnej	Gaymar	TP500C	Do pompowania ciepłej wody do konwekcyjnej podkładki grzewczej.
Podkładka do podgrzewania konwekcji wodnej	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	Do stosowania w obszarze rekonwalescencji pooperacyjnej w celu utrzymania temperatury ciała nieprzytomnego zwierzęcia.
Haki obciążeniowe	N/A	N/A	Do utrzymywania otwartej rany pooperacyjnej.