Celowane dostarczanie substancji do mózgu myszy poprzez infuzję do tętnicy szyjnej wewnętrznej

Streszczenie

Źródło: Leda, A. R., et al. Technika infuzji mikrochirurgicznej myszy do celowanego dostarczania substancji do OUN przez tętnicę szyjną wewnętrzną. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film przedstawia procedurę mikrochirurgiczną mającą na celu ułatwienie celowanej infuzji substancji badanej do mózgu przez tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA). Zabieg polega na precyzyjnym szyciu i manipulacji naczyniami krwionośnymi w celu czasowego ograniczenia przepływu krwi, zapewniając kontrolowane dostarczanie. Rurka kapilarna jest wprowadzana do tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA) i przesuwana w kierunku rozwidlenia. Po infuzji substancja omija krążenie ogólnoustrojowe, przekracza barierę krew-mózg i osiąga celowe dostarczenie do miąższu mózgu.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie myszy do zabiegu chirurgicznego

1. Znieczulić mysz izofluranem zmieszanym z tlenem, za pomocą laboratoryjnego systemu anestezjologicznego. Używaj izofluranu przy ustawieniu między 4-5% i przepływie tlenu na poziomie 2 l/min w maszynie komercyjnej (patrz tabela materiałów). Przenieść zwierzę na powierzchnię operowaną pod mikroskopem stereoskopowym i podtrzymać znieczulenie za pomocą stożka nosowego (użyć izofrelanu przy ustawieniu 1,5 - 2,5 i przepływu tlenu na poziomie 2 l/min).
   1. Upewnij się, że częstość oddechów myszy wynosi około 1 - 2 oddechów/s bez łapania oddechu. Ponadto upewnij się, że zwierzę nie wykazuje reakcji stymulacji wąsów i odruchu pedałowania (szczypania palców). Monitoruj częstość oddechów i wysiłek podczas zabiegu, co najmniej co 5 minut. Postępuj zgodnie ze specjalnymi wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt oraz wytycznymi weterynaryjnymi dotyczącymi monitorowania znieczulenia gryzoni.
2. Nałóż kroplę lubrykantu okulistycznego na każde oko za pomocą sterylnego wacika, aby zapobiec wysuszeniu. Zaleca się podawanie leków przeciwzapalnych i przeciwbólowych w celu złagodzenia dyskomfortu.
3. Gdy zwierzę leży na plecach, utrzymuj znieczulenie za pomocą stożka nosowego.
4. Oczyść obszar szyi zwierzęcia, przecierając go trzykrotnie etanolem 70% i chlorheksydyną. Ogol obszar operacyjny zwierzęcia za pomocą brzytwy (szczegóły poniżej).

2. Rozwarstwienie tętnicy szyjnej wspólnej (CCA)

1. Całą procedurę mikrochirurgiczną należy wykonać pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy wykonaj płytkie nacięcie w linii środkowej szyi, od góry mostka do poniżej żuchwy (około 3 do 4 cm).
2. Za pomocą kleszczy ostrożnie oddziel tkankę tłuszczową i łączną, aby odsłonić tchawicę.
3. Umieść poduszkę (okrągły przedmiot o średnicy około 0,5 cm) z tyłu szyi myszy, aby przedłużyć szyję, dodatkowo odsłaniając obszar.
4. Oddziel tkankę za pomocą zwijacza tkanki lub haczyków.
5. Po lewej stronie tchawicy zwierzęcia ostrożnie rozsuń tkankę łączną, aby odsłonić lewe CCA.
6. Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń całą tkankę łączną, aby odsłonić rozwidlenie CCA i początek tętnic szyjnych zewnętrznych, jak i wewnętrznych.

3. Przygotowanie CCA do infuzji substancji

1. Wprowadzić dwa segmenty nylonowego szwu (około 1 cm każdy) pod tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) za pomocą kleszczy.
2. Umieść stały węzeł w najwyższym możliwym punkcie ETO.
3. W najniższym możliwym punkcie ECA, bezpośrednio nad rozwidleniem CCA, umieść rozsuwany węzeł. Ten węzeł powinien być luźny w porównaniu z górnym węzłem.
4. Zamknij CCA za pomocą zacisku do naczynia, w najniższym możliwym punkcie.
5. Zamknij tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA) za pomocą zacisku do naczynia.
6. Za pomocą nożyczek sprężynowych do mikrodysekcji wykonaj małe nacięcie w ECA (około 2 mm), między dwoma węzłami.

4. Wlew substancji za pomocą ICA

1. Zmontuj system infuzyjny. Podłącz 6 cali rurki kapilarnej (idealne wymiary: 2,5 mm x 1,2 mm) do strzykawki tuberkulinowej zawierającej 250 μl substancji, która ma być podawana (między innymi leki, patogeny, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe) i delikatnie włóż końcówkę kapilary do nacięcia wykonanego w kroku 3.6.
2. Kontynuuj przesuwanie się w dół kapilary, aż osiągnie punkt środkowy między rozwidleniem a zaciskiem zamykającym CCA.
3. Zawiąż dolny węzeł ECA. Sprawdź, czy węzeł jest wystarczająco luźny, aby zapewnić płynność kapilarną i wystarczająco szczelny, aby zapobiec wyciekowi.
4. Usuń klips z ICA.
5. Delikatnie docisnąć tłok strzykawki, umożliwiając infuzję substancji w tempie około 10 μl na sekundę.

5. Procedury po infuzji

1. Umieść klips z powrotem na ICA.
2. Delikatnie wyjmij rurkę kapilarną.
3. Całkowicie zwiąż dolny węzeł ECA.
4. Usuń klipy z ICA i CCA.

6. Zamykanie nacięcia i opieka pooperacyjna

1. Usuń retraktor lub haczyki na chusteczki i poduszkę.
2. Oczyść obszar szwu za pomocą sterylnej soli fizjologicznej.
3. Zamknij nacięcie za pomocą nylonowego szwu/igły i kleszczy.
4. Podawaj leki przeciwzapalne i przeciwbólowe, aby złagodzić dyskomfort pooperacyjny.
5. Umieść zwierzę w klatce umieszczonej na poduszce grzewczej na co najmniej 1 godzinę i monitoruj powrót do zdrowia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przyrząd anestezjologiczny	Vetequip	901806
Nożyczki chirurgiczne	Fine Science Tool	14558-09
Kleszcze chirurgiczne z prostą końcówką	Fine Science Tool	00108-11
Kleszcze chirurgiczne z końcówką kątową	Fine Science Tool	00109-11
Nożyczki sprężynowe	Fine Science Tool	15000-08
Szew nylonowy	Braintree Scientific	SUT-S 104
Rurka kapilarna (Micro-Renathane 0,010" x 0,005" na stopę)	Braintree Scientific	MRE01050
Szew zamykający	VWR	95057-036
Chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu	Isoflurane

Piramal FisherScientific 50-121-8005