Doświadczalne generowanie fibroblastów towarzyszących rakowi (CAF) z ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego

Podsumowanie

Fibroblasty związane z rakiem (CAFs), bogate w myofibroblasty obecne w zrębie guza, odgrywają kluczową rolę w stymulowaniu progresji nowotworu. Opracowaliśmy model ksenoprzeszczepu guza z jednoczesną implantacją w celu eksperymentalnego generowania CAF z ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego. Protokół opisuje sposób tworzenia myofibroblastów CAF, które nabywają zdolności do promowania tumorigennezy.

Streszczenie

Rakowiaki są złożonymi tkankami składającymi się z komórek nowotworowych oraz komponentu niezłośliwego, określanego mianem „zrębu”. Zrąb składa się z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) oraz różnorodnych komórek mezenchymalnych, w tym fibroblastów, myofibroblastów, komórek śródbłonka, perycytów i leukocytów ^1-3.

Zraz zorientowany na guz odpowiada na liczne sygnały parakrynne uwalniane przez sąsiadujące komórki raka. W przebiegu choroby zraz często zostaje zasiedlony przez fibroblasty związane z rakiem (CAF), w tym liczne miofibroblasty. Komórki te były wcześniej izolowane z wielu różnych typów ludzkich raków w celu ich hodowli in vitro. Subpopulację CAF można odróżnić na podstawie zwiększonej ekspresji α-aktyny mięśni gładkich (α-SMA)^4,5. Komórki te są cechą charakterystyczną dla „aktywowanych fibroblastów”, które wykazują właściwości podobne do miofibroblastów powszechnie obserwowanych w uszkodzonych i zwłókniałych tkankach ⁶. Obecność tej miofibroblastycznej podgrupy CAF jest ściśle związana z nowotworami wysokiego stopnia złośliwości i wiąże się ze złym rokowaniem u pacjentów.

Wiele laboratoriów, w tym nasze, wykazało, że CAF-y po wstrzyknięciu wraz z komórkami raka do myszy z niedoborem odporności są w stanie znacznie promować tumorigenezę ^7-10. Jednak CAF-y pozyskane od pacjentów z rakiem często ulegają starzeniu podczas hodowli, co ogranicza możliwość ich szerokiego wykorzystania w toku prowadzonych eksperymentów. Aby przezwyciężyć tę trudność, opracowaliśmy nową technikę eksperacyjnego generowania unieśmiertelnionych linii komórkowych ludzkich CAF gruczołu piersiowego (exp-CAF) z ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego, wykorzystując model ksenoprzeszczepu guza piersi z implantacją współdzieloną.

W celu wygenerowania exp-CAF, macierzyste ludzkie fibroblasty gruczołu piersiowego, uzyskane z tkanki po redukcyjnej mammoplastyce, zostały najpierw unieśmiertelnione za pomocą hTERT, katalitycznej podjednostki holoenzymu telomerazy, oraz zmodyfikowane tak, aby eksponowały GFP oraz gen oporności na puromycynę. Komórki te zostały współimplantowane wraz z ludzkimi komórkami raka piersi MCF-7 eksponującymi aktywny onkogen ras (komórki MCF-7-ras) do ksenoprzeszczepu mysiego. Po okresie inkubacji in vivo, pierwotnie wstrzyknięte ludzkie fibroblasty gruczołu piersiowego wyekstrahowano z ksenoprzeszczepów nowotworowych na podstawie ich oporności na puromycynę ¹¹.

Zaobserwowaliśmy, że rezydentne ludzkie fibroblasty piersi uległy różnicowaniu, przyjmując fenotyp miofibroblastyczny i nabywając właściwości pronowotworowe w przebiegu progresji guza. Co istotne, komórki te, zdefiniowane jako exp-CAF, ściśle naśladują pronowotworowy fenotyp miofibroblastyczny CAF izolowanych z raków piersi pobranych od pacjentów. Zatem nasze exp-CAF pochodzące z ksenoprzeszczepów nowotworowych stanowią skuteczny model do badania biologii CAF w ludzkich rakach piersi. Opisany protokół można również rozszerzyć w celu generowania i charakteryzowania różnych populacji CAF pochodzących z innych typów raków ludzkich.

Protokół

1. Izolacja pierwotnych hodowli ludzkich normalnych fibroblastów gruczołu piersiowego

Procedury eksperymentalne dotyczące izolacji pierwotnych hodowli ludzkich prawidłowych fibroblastów gruczołu piersiowego przedstawiono na Rys. 1A.

1. Przygotować bufor do dysocjacji komórek zgodnie z wcześniejszym opisem¹²: podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) z 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), penicyliną-streptomycyną (200 units/ml), kolagenazą typu I (1 mg/ml) oraz hialuronidazą (125 units/ml).
2. Tkankę piersi pobraną podczas plastyki redukcyjnej (~0.5 gram) kilkukrotnie przemyć w solance fosforanowej (PBS). Tkankę rozdrobnić na małe fragmenty (<1.5 mm³) za pomocą sterylnych żyletek.
3. Fragmenty tkanki przenieść do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej odpowiednią ilość powyższego buforu do dysocjacji komórek (10 ml na 0.5 gram tkanki) i mieszać na wirówce typu vortex przez 1 min z maksymalną prędkością.
4. Trawić fragmenty tkanki w buforze do dysocjacji komórek przez 12-18 h w temperaturze 37°C przy wolnym mieszaniu. ^*Należy pamiętać, że w probówce pozostanie wciąż wiele nieprzetrawionych fragmentów tkanki.
5. Inkubować probówkę przez 5 min w temperaturze pokojowej bez mieszania. Powstały nadsącz wzbogacony w komórki zrębowe przenieść do nowej probówki stożkowej za pomocą pipety serologicznej 5 ml.
6. Frakcję zrębową wirować przez 5 min przy 250 X g i resuspendować osad komórkowy w PBS. Wirować ponownie przez 5 min przy 250 X g i resuspendować osad komórkowy w podłożu DMEM uzupełnionym o 10% FCS. Hodować komórki w podłożu DMEM zawierającym 10% FCS w szalce Petriego o średnicy 15 cm w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla.
7. Namnażać komórki do momentu uzyskania konfluencji. Zazwyczaj trwa to 8-10 dni. Komórki przechowywać w temperaturze -80°C w medium do mrożenia (10% dimetylosulfoksyd i 20% FCS w DMEM). Przygotować 5 zamrożonych fiolek jako zapas pierwotny. Rozmrozić jedną fiolkę i namnożyć komórki, aby przygotować 5 fiolek zapasu wtórnego zawierającego fibroblasty pasażowane w obrębie 5 podwojeń populacji (PDs) do kolejnych eksperymentów. Procedury te minimalizują selekcję klonalną oraz stres hodowlany, które mogłyby wystąpić podczas przedłużonej hodowli tkankowej. ^*Należy pamiętać, że procedury P1.1-7 mogą być również stosowane do izolacji CAF z raków piersi pobranych podczas mastektomii¹².

2. Generowanie unieśmiertelnionych ludzkich normalnych fibroblastów piersiowych, znakowanych GFP i opornych na puromycynę

1. Aby unieśmiertelnić pierwotne ludzkie normalne fibroblasty piersiowe wyizolowane w P1.7), wprowadź wektor retrowirusowy pMIG (MSCV-IRES-GFP)¹², wykazujący ekspresję zarówno hTERT, jak i GFP. Hoduj komórki przez 4-5 dni, a następnie wyselekcjonuj komórki GFP-dodatnie za pomocą cytometrii przepływowej.
2. Wprowadź konstrukt retrowirusowy pBabe-puro kodujący gen oporności na puromycynę do oznakowanych GFP unieśmiertelnionych fibroblastów. Hoduj komórki przez 5-7 dni w obecności puromycyny (stężenie końcowe: 1 μg/ml), aby wyizolować GFP-dodatnie (GFP+), oporne na puromycynę (puro^R) unieśmiertelnione ludzkie fibroblasty piersiowe.
3. Następnie, aby zbadać, czy fibroblasty te produkują aktywne wirusy, co może prowadzić do horyzontalnego transferu genów kodujących GFP i oporność na puromycynę, wyhoduj 2,5x10⁵ GFP+puro^R unieśmiertelnionych ludzkich fibroblastów piersiowych w 6 cm szalce Petriego przez 2 dni.
4. Przefiltruj medium warunkowane przez te fibroblasty za pomocą filtra strzykawkowego (rozmiar porów: 0,45 μm) i dodaj je do mysich komórek fibroblastycznych 10T1/2 na 12h w obecności siarczanu protaminy (5 μg/ml), który zwiększa wydajność infekcji wirusowej. Następnie zmień medium na 10% FCS-DMEM na kolejne 2 dni.
5. Zbadaj komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki 10T1/2 zainfekowane wirusem GFP staną się GFP-dodatnie. Poddaj komórki działaniu puromycyny (1 μg/ml) przez 5-7 dni i obserwuj szalkę, czy występują jakiekolwiek komórki 10T1/2 puro^R i czy tworzą one kolonie po traktowaniu puromycyną.
6. Należy zauważyć, że horyzontalny transfer genów za pomocą aktywnych wirusów produkowanych przez rodzicele GFP+puro^R ludzkie fibroblasty piersiowe może sprawić, że otaczające mysie komórki i/lub komórki raka staną się GFP+puro^R w obrębie ksenoprzeszczepów nowotworowych. Może to utrudnić procesy izolacji początkowo wstrzykniętych GFP+puro^R ludzkich fibroblastów piersiowych z ksenoprzeszczepów nowotworowych.

3a. Współiniekcja ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego wraz z komórkami raka piersi do myszy z niedoborem odporności

Procedury eksperymentalne służące do generowania exp-CAF przedstawiono na rys. 1Ba.

1. Wymieszać 1x10⁶ komórek raka piersi człowieka MCF-7-ras oraz 3x10⁶ GFP⁺puro^R unieśmiertelnionych fibroblastów gruczołu piersiowego człowieka wytworzonych w P2.2). Przygotować komórki w 400 μl pożywki hodowlanej z 50% (v/v) Matrigel na jedną iniekcję.
2. Wstrzyknąć mieszaninę komórek podskórnie w immunodeficyjną mysz naga. W przypadku niezależnego pozyskiwania CAF z różnych guzów, wszczepić każdą mieszaninę w prawy i lewy bok kilku myszy.

3b. Iniekcja ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego do myszy z niedoborem odporności

1. Aby wygenerować fibroblasty kontrolne w opozycji do exp-CAFs, przygotować 3x10⁶ unieśmiertelnionych ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego GFP⁺puro^R wygenerowanych w P2.2 w 400 μl pożywki hodowlanej z 50% (v/v) Matrigel na jedną iniekcję (Ryc. 1Bb). NIE mieszać fibroblastów z komórkami raka.
2. Zaimplantować fibroblasty przygotowane w P3b.1 w miejsca podskórne myszy nude.

^*Należy pamiętać, że zaszczepione fibroblasty utworzą tkankę fibroblastyczną, a nie guz pod skórą.

4a. Disekcja ksenoprzeszczepu nowotworowego

1. Uśmierć mysz z podskórnym ksenoprzeszczepem ludzkiego raka piersi 42 dni po implantacji (Rys. 1Ba). ^*Należy pamiętać, że w przypadku współimplantacji innych komórek raka i/lub fibroblastów, fibroblasty mogą wymagać inkubacji w ksenoprzeszczepie nowotworowym przez okres dłuższy niż 42 dni, aby zainicjować swój fenotyp miofibroblastyczny.
2. Pobierz ksenoprzeszczep nowotworu z boku myszy, stosując rozszerzanie tępe za pomocą pęsety i nożyczek. Zanurz tkankę nowotworową w PBS.

4b. Disekcja ksenoprzeszczepu fibroblastów

1. Uśmierć mysz z ksenoprzeszczepem fibroblastów 42 dni po implantacji (Rys. 1Bb).
2. Wypreparuj podskórny ksenoprzeszczep fibroblastów za pomocą pęsety i nożyczek. Umieść tkankę fibroblastyczną w PBS. ^*Należy pamiętać, że ksenoprzeszczep fibroblastów, który wygląda jak niewielka przezroczysta tkanka, może być trudny do odnalezienia pod skórą.

5. Przygotowanie pierwotnych kultur komórkowych z ksenoprzeszczepów

1. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza należy przeprowadzić sekcję guza (˜0.5 gram) lub tkanki fibroblastycznej (˜0.1 gram). Wycięte tkanki przenieść na dno 15 cm szalki hodowlanej z 1 ml PBS. Tkanki posiekać na małe fragmenty (<1.5 mm³) za pomocą sterylnych żyletek. *Uwaga: jeśli ksenoprzeszczep fibroblastyczny waży mniej niż 0.1 gram, należy zebrać kilka dodatkowych ksenoprzeszczepów i wymieszać je ze sobą, aby zwiększyć liczbę komórek do izolacji.
2. Fragmenty tkanki przenieść do 15 ml probówki stożkowej zawierającej bufor do dysocjacji komórek (10 ml na 0.5 gram tkanki) i mieszać w wirówce typu vortex przez 1 min z maksymalną prędkością.
3. Zawiesinę komórkową inkubować przez 3 h w temperaturze 37°C przy ciągłym, wolnym mieszaniu.

6. Izolacja komórek opornych na puromycynę w hodowli

1. Odwiruj zawiesinę komórkową wydzieloną z ksenoprzeszczepu guza lub fibroblastów przez 5 min przy 250 X g, a następnie resuspenduj osad komórkowy w PBS. Odwiruj ponownie przez 5 min przy 250 X g. Resuspenduj otrzymany osad komórkowy w 10% FCS-DMEM. Hoduj komórki w 15 cm szalce Petriego w obecności puromycyny (1 μg/ml) w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla, aby wyeliminować wszelkie zanieczyszczające komórki raka i/lub mysie komórki zrębu. Namnażaj komórki do momentu osiągnięcia konfluencji (2-4 tygodnie). Przechowuj komórki w temperaturze -80°C, używając medium do mrożenia. *Należy zauważyć, że otrzymane komórki puro^R, oznaczone jako 42-day-old exp-CAF1 (Ryc. 1Ba) lub kontrolne komórki fibroblast-1 (Ryc. 1Bb), są nieśmiertelne i wykazują pozytywny wynik dla GFP. Zaleca się sprawdzenie, czy komórki te produkują aktywne wirusy, wykorzystując komórki 10T1/2, zgodnie z opisem w P2.3-6.

7a. Izolacja komórek exp-CAF2 w hodowli

Aby dodatkowo wzmocnić aktywowany fenotyp miofibroblastyczny CAF, zmieszać 42-dniowe komórki exp-CAF1 z komórkami MCF-7-ras i ponownie wstrzyknąć je podskórnie myszy nude na dodatkowy okres 200 dni. Wypreparować i zdysocjować ksenoprzeszczep nowotworowy do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, a następnie hodować komórki w 15 cm szalce Petriego w DMEM z 10% FCS w obecności puromycyny (1 μg/ml), zgodnie z opisem w P6.1. Namnażać komórki do momentu osiągnięcia konfluencji (8-10 dni). Przechowywać komórki w temperaturze -80°C przy użyciu medium do mrożenia. Otrzymane komórki puro^R nazwano 242-dniowymi komórkami exp-CAF2 (Ryc. 1Ba).

7b. Ekstrakcja kontrolnych hodowli komórek fibroblast-2

Aby uzyskać fibroblasty kontrolne przeciwko komórkom exp-CAF2, wstrzyknij podskórnie u myszy nude same komórki kontrolnego fibroblasta-1 w wieku 42 dni, bez komórek raka, i utrzymuj przez kolejne 200 dni. Wypreparuj i zdysocjuj tkankę fibroblastyczną do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, a następnie hoduj komórki w 15 cm szalce Petriego w pożywce 10% FCS-DMEM z dodatkiem puromycyny (1 μg/ml), zgodnie z opisem w P6.1. Namnażaj komórki do momentu uzyskania konfluencji (3-4 tygodnie). Przechowuj komórki w temperaturze -80°C w medium do zamrażania. Uzyskane komórki puro^R nazwano komórkami kontrolnego fibroblasta-2 (Rys. 1Bb).

8. Reprezentatywne wyniki:

Kontrolne komórki fibroblast-2 oraz exp-CAF2, wyizolowane z ksenoprzeszczepów guzów piersi, wykazały silnie dodatnie barwienie na markery mezenchymalne, w tym specyficzną dla ludzi wimentynę, prolylo-4-hydroksylazę, kolagen 1A, fibronektynę, S100A4 oraz białko powierzchniowe fibroblastów (Rys. 2A)¹¹, co wskazuje na ludzkie pochodzenie i charakter mezenchymalny tych komórek. Z kolei cytokeratyna, będąca markerem komórek nabłonkowych, nie uległa zabarwieniu w tych fibroblastach GFP⁺ (Rys. 2B). Wyniki te sugerują zatem, że wyizolowane komórki exp-CAF2 i kontrolne fibroblast-2 pochodzą od rodzicielskich ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego, które zostały początkowo wprowadzone do ksenoprzeszczepów mysich.

Co istotne, wyższy odsetek komórek exp-CAF2 barwił się dodatnio na α-SMA oraz glikoproteinę macierzy zewnątrzkomórkowej tenascynę-C⁵, które są markerami miofibroblastów, w porównaniu do 42-dniowych komórek exp-CAF1 oraz kontrolnych fibroblastów-2 (Ryc. 2C, D)¹¹. Dane te wskazują, że rezydentne ludzkie fibroblasty gruczołu piersiowego stopniowo przekształcają się w miofibroblasty CAF w ksenograftach nowotworowych.

Rycina 1 Schematyczna reprezentacja izolacji ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego. A) Tkankę z plastyki redukcyjnej piersi posiekano za pomocą sterylnych żyletek (P1.2) i przeniesiono do stożkowej probówki 15 ml (P1.3). Małe fragmenty tkanki poddano trawieniu w buforze do dysocjacji komórek (P1.4) i przygotowano do hodowli in vitro (P1.5-7). Aby unieśmiertelić wyizolowane pierwotne ludzkie fibroblasty gruczołu piersiowego, wprowadzono retrowirusowy wektor pMIG (MSCV-IRES-GFP), wykazujący ekspresję zarówno hTERT, jak i GFP, a otrzymane komórki GFP-dodatnie posortowano przy użyciu cytometrii przepływowej (P2.1). Następnie do tych komórek wprowadzono retrowirusowy wektor pBabe-puro kodujący gen oporności na puromycynę. Po zastosowaniu puromycyny wyizolowano unieśmiertelone ludzkie fibroblasty gruczołu piersiowego znakowane GFP (GFP⁺) i oporne na puromycynę (Puro^R) (P2.2).

Ba) W celu wygenerowania exp-CAF, unieśmiertelnione ludzkie fibroblasty gruczołu piersiowego GFP⁺puro^R wstrzyknięto wspólnie z komórkami raka piersi MCF-7-ras podskórnie immunodeficyjnej myszy naga (P3a). Ksenoprzeszczep guza wycięto 42 dni po implantacji (P4a) i poddano dysocjacji do zawiesiny pojedynczych komórek (P5). Komórki te hodowano następnie in vitro w obecności puromycyny, aby wyeliminować wszelkie zanieczyszczające komórki raka oraz komórki stromalne myszy (P6). Uzyskane komórki oporne na puromycynę określono jako eksperymentalnie wygenerowane komórki CAF1 (exp-CAF1). Komórki te, wycięte 42 dni po implantacji, ponownie zmieszano z komórkami MCF-7-ras i zaimplantowano podskórnie myszy biorcy w taki sam sposób jak poprzednio (P7a). Powstałemu guzowi pozwolono rosnąć przez dodatkowe 200 dni, a następnie go wycięto, poddano dysocjacji i hodowano w obecności puromycyny. Wyizolowane komórki oporne na puromycynę określono jako komórki exp-CAF2 (wiek 242 dni).

Bb)W celu wyizolowania komórek kontrolnych do porównania z exp-CAF, unieśmiertelnione ludzkie fibroblasty gruczołu piersiowego GFP⁺puro^R wstrzyknięto podskórnie myszy nude jako czyste hodowle, bez dodatku komórek MCF-7-ras (P3b). Tkankę fibroblastyczną, wyciętą 42 dni po implantacji (P4b), rozdzielono do zawiesin pojedynczych komórek (P5), a komórki oporne na puromycynę, nazwane komórkami fibroblastów kontrolnych-1, wyizolowano zgodnie z wcześniejszym opisem (P6). Fibroblasty te ponownie implantowano podskórnie myszy nude, ponownie bez komórek MCF-7-ras, na okres 200 dni (P7b). Tkankę fibroblastyczną wycięto, rozdzielono i hodowano w obecności puromycyny. Wyizolowane komórki oporne na puromycynę nazwano komórkami fibroblastów kontrolnych-2 (w wieku 242 dni).

Rysunek 2 Exp-CAF i fibroblasty kontrolne pochodzą od macierzystych ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego. (A) Analizy immunofluorescencyjne komórek fibroblastu kontrolnego-2 (control f.) i exp-CAF2. Oba typy komórek wykazują pozytywne barwienie na markery mezenchymalne (czerwony), w tym ludzką wimentynę, prolylo-4-hydroksylazę, kolagen 1A, fibronektynę, S100A4 oraz białko powierzchniowe fibroblastów. (B) W przeciwieństwie do tego, pan-cytokeratyna, marker komórek nabłonkowych, nie jest wykrywana w komórkach exp-CAF2 exprimujących GFP (zielony). Jądra komórkowe są barwione 4'-6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) (niebieski). Pasek skali, 50 μm (za: Kojima et al.¹¹)

(C) Immunofluorescencja komórek exp-CAF2 oraz kontrolnych fibroblastów-2 (control f.) z użyciem przeciwciał przeciwko α-SMA (czerwony) lub tenascynie-C (TN-C) (czerwony). Jądra komórkowe są barwione DAPI (niebieski). Pasek skali, 50 μm. (D) 48% komórek exp-CAF2 wykazuje pozytywne barwienie na α-SMA, podczas gdy 14% 42-dniowych komórek exp-CAF1 oraz 2,5% populacji kontrolnych fibroblastów-2 jest pozytywnych pod kątem α-SMA. (adapted from Kojima et al.11)

Dyskusja

Brak markerów specyficznych dla CAF oraz poziom heterogeniczności obserwowany wśród tych komórek sprawiają, że charakterystyka tego typu komórek stanowi samo w sobie wyzwanie. Badania nad CAF in vitro były dodatkowo utrudnione przez fakt, że komórki te ulegają starzeniu i przestają proliferować podczas długotrwałej hodowli. Nasza poprzednia próba bezpośredniej immortalizacji pierwotnych CAF z użyciem retrowirusowej konstrukcji cDNA hTERT zakończyła się niepowodzeniem. Aby zatem dalej badać właściwości pronowotwo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Invitrogen	61965-026
Surowica z płodu cielęcego	GIBCO, firmy Life Technologies	10270
Penicylina-streptomycyna	Invitrogen	15140-122
Kolagenaza typu I	Sigma-Aldrich	C0130-1G
hialuronidaza	Sigma-Aldrich	H4272
Przeciwciało przeciwko wimentynie (V9)	Novocastra Laboratories	NCL-L- VIM-V9
Przeciwciało przeciwko tenascynie C (BC-8)			uprzejmie otrzymany od dr Luciano Zardi
αprzeciwciało -SMA-Cy3 (1A4)	Sigma-Aldrich	C6198
Prolilo-4-hydroksylaza	Dako	M0877
przeciwciało (5B5)
Przeciwciało przeciwko kolagenowi typu 1 1A	Sigma-Aldrich	HPA011795
Przeciwciało przeciwko pankytokeratynie	Sigma-Aldrich	C5992
Przeciwciało przeciwko fibronektynie	BD Biosciences	610077
S100A4/FSP-1 (białko specyficzne dla fibroblastów- przeciwciało przeciwko białku specyficznemu 1 (specific protein-1)	Dako	A5114
Białko powierzchniowe fibroblastów przeciwciało (klon 1B10)	Abcam	ab11333
konstrukt MSCV-IRES-GFP			Prośba do autorów
konstrukt pBabe-puro			Zakup z Addgene
Puromycyna	Sigma-Aldrich	P8833
DAPI	Sigma-Aldrich	D9564
probówka stożkowa 15 ml	Corning	430766
Myszy nago (myszy nude)	Taconic	NCRNU-F	Samice myszy NCr nude
komórki C3H/10T1/2	ATCC		CCL-226