Doświadczalne generowanie fibroblastów towarzyszących rakowi (CAF) z ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego

Podsumowanie

Fibroblasty związane z rakiem (CAFs), bogate w myofibroblasty obecne w zrębie guza, odgrywają kluczową rolę w stymulowaniu progresji nowotworu. Opracowaliśmy model ksenoprzeszczepu guza z jednoczesną implantacją w celu eksperymentalnego generowania CAF z ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego. Protokół opisuje sposób tworzenia myofibroblastów CAF, które nabywają zdolności do promowania tumorigennezy.

Streszczenie

Rakowiaki są złożonymi tkankami składającymi się z komórek nowotworowych oraz komponentu niezłośliwego, określanego mianem „zrębu”. Zrąb składa się z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) oraz różnorodnych komórek mezenchymalnych, w tym fibroblastów, myofibroblastów, komórek śródbłonka, perycytów i leukocytów ^1-3.

Zraz zorientowany na guz odpowiada na liczne sygnały parakrynne uwalniane przez sąsiadujące komórki raka. W przebiegu choroby zraz często zostaje zasiedlony przez fibroblasty związane z rakiem (CAF), w tym liczne miofibroblasty. Komórki te były wcześniej izolowane z wielu różnych typów ludzkich raków w celu ich hodowli in vitro. Subpopulację CAF można odróżnić na podstawie zwiększonej ekspresji α-aktyny mięśni gładkich (α-SMA)^4,5. Komórki te są cechą charakterystyczną dla „aktywowanych fibroblastów”, które wykazują właściwości podobne do miofibroblastów powszechnie obserwowanych w uszkodzonych i zwłókniałych tkankach ⁶. Obecność tej miofibroblastycznej podgrupy CAF jest ściśle związana z nowotworami wysokiego stopnia złośliwości i wiąże się ze złym rokowaniem u pacjentów.

Wiele laboratoriów, w tym nasze, wykazało, że CAF-y po wstrzyknięciu wraz z komórkami raka do myszy z niedoborem odporności są w stanie znacznie promować tumorigenezę ^7-10. Jednak CAF-y pozyskane od pacjentów z rakiem często ulegają starzeniu podczas hodowli, co ogranicza możliwość ich szerokiego wykorzystania w toku prowadzonych eksperymentów. Aby przezwyciężyć tę trudność, opracowaliśmy nową technikę eksperacyjnego generowania unieśmiertelnionych linii komórkowych ludzkich CAF gruczołu piersiowego (exp-CAF) z ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego, wykorzystując model ksenoprzeszczepu guza piersi z implantacją współdzieloną.

W celu wygenerowania exp-CAF, macierzyste ludzkie fibroblasty gruczołu piersiowego, uzyskane z tkanki po redukcyjnej mammoplastyce, zostały najpierw unieśmiertelnione za pomocą hTERT, katalitycznej podjednostki holoenzymu telomerazy, oraz zmodyfikowane tak, aby eksponowały GFP oraz gen oporności na puromycynę. Komórki te zostały współimplantowane wraz z ludzkimi komórkami raka piersi MCF-7 eksponującymi aktywny onkogen ras (komórki MCF-7-ras) do ksenoprzeszczepu mysiego. Po okresie inkubacji in vivo, pierwotnie wstrzyknięte ludzkie fibroblasty gruczołu piersiowego wyekstrahowano z ksenoprzeszczepów nowotworowych na podstawie ich oporności na puromycynę ¹¹.

Zaobserwowaliśmy, że rezydentne ludzkie fibroblasty piersi uległy różnicowaniu, przyjmując fenotyp miofibroblastyczny i nabywając właściwości pronowotworowe w przebiegu progresji guza. Co istotne, komórki te, zdefiniowane jako exp-CAF, ściśle naśladują pronowotworowy fenotyp miofibroblastyczny CAF izolowanych z raków piersi pobranych od pacjentów. Zatem nasze exp-CAF pochodzące z ksenoprzeszczepów nowotworowych stanowią skuteczny model do badania biologii CAF w ludzkich rakach piersi. Opisany protokół można również rozszerzyć w celu generowania i charakteryzowania różnych populacji CAF pochodzących z innych typów raków ludzkich.

Protokół

1. Izolacja pierwotnych kultur ludzkich normalnych fibroblastów piersi

Procedury eksperymentalne służące do izolacji pierwotnych hodowli normalnych ludzkich fibroblastów piersi przedstawiono na Rys. 1A.

1. Przygotować bufor do dysocjacji komórek zgodnie z wcześniejszym opisem¹²: podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) z 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), penicyliną-streptomycyną (200 units/ml), kolagenazą typu I (1 mg/ml) oraz hialuronidazą (125 units/ml).
2. Tkankę piersi pobraną podczas mammoplastyki redukcyjnej (~0,5 gram) kilkukrotnie przemyć w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Tkankę posiekać na małe fragmenty (<1,5 mm³) za pomocą sterylnych żyletek.
3. Fragmenty tkanki przenieść do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej odpowiednią ilość powyższego buforu do dysocjacji komórek (10 ml na 0,5 gram tkanki) i mieszać w vortexie przez 1 min z maksymalną prędkością.
4. Trawić fragmenty tkanki w buforze do dysocjacji komórek przez 12-18 h w temperaturze 37°C przy wolnym mieszaniu. ^*Należy pamiętać, że w probówce pozostanie wciąż wiele nieprzetrawionych fragmentów tkanki.
5. Inkubować probówkę przez 5 min w temperaturze pokojowej bez mieszania. Otrzymany nadsącz wzbogacony w komórki zrębu przenieść do nowej probówki stożkowej za pomocą pipety serologicznej 5 ml.
6. Frakcję zrębu wirować przez 5 min przy 250 X g, a osad komórkowy resuspender w PBS. Ponownie wirować przez 5 min przy 250 X g i resuspender osad komórkowy w podłożu DMEM uzupełnionym o 10% FCS. Hodować komórki w podłożu DMEM z 10% FCS w szalce Petriego o średnicy 15 cm w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla.
7. Namnażać komórki aż do uzyskania konfluencji, co zazwyczaj trwa 8-10 dni. Komórki przechowywać w temperaturze -80°C w medium do zamrażania (10% dimetylosulfoksyd i 20% FCS w DMEM). Przygotować 5 zamrożonych fiolek jako zapas pierwotny. Rozmrozić jedną fiolkę i namnożyć komórki, aby przygotować 5 fiolek zapasu wtórnego zawierającego fibroblasty z pasażem nieprzekraczającym 5 podwojeń populacyjnych (PDs) do kolejnych eksperymentów. Procedury te minimalizują selekcję klonalną i stres hodowlany, które mogłyby wystąpić podczas przedłużonej hodowli tkankowej. ^*Należy pamiętać, że procedurę P1.1-7 można również stosować do izolacji CAF z raków piersi pobranych podczas mastektomii¹².

2. Generowanie unieśmiertelnionych ludzkich normalnych fibroblastów piersiowych, opornych na puromycynę i znakowanych GFP

1. Aby unieśmiertelnić pierwotne ludzkie normalne fibroblasty gruczołu piersiowego wyizolowane w P1.7), wprowadź wektor retrowirusowy pMIG (MSCV-IRES-GFP)¹², wykazujący ekspresję hTERT oraz GFP. Hoduj komórki przez 4-5 dni, a następnie wyselekcjonuj komórki GFP-dodatnie za pomocą cytometrii przepływowej.
2. Wprowadź konstrukt retrowirusowy pBabe-puro kodujący gen oporności na puromycynę do znakowanych GFP unieśmiertelnionych fibroblastów. Hoduj komórki przez 5-7 dni w obecności puromycyny (stężenie końcowe: 1 μg/ml), aby wyizolować GFP-dodatnie (GFP+), oporne na puromycynę (puro^R) unieśmiertelnione ludzkie fibroblasty gruczołu piersiowego.
3. Następnie, aby zbadać, czy fibroblasty te produkują aktywne wirusy, które mogą prowadzić do horyzontalnego transferu genów kodujących GFP i oporność na puromycynę, hoduj 2,5x10⁵ GFP+puro^R unieśmiertelnionych ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego w szalce Petriego o średnicy 6 cm przez 2 dni.
4. Przefiltruj medium warunkowane przez te fibroblasty za pomocą filtra strzykawkowego (rozmiar porów: 0,45 μm) i dodaj je do mysich komórek fibroblastycznych 10T1/2 na 12h w obecności siarczanu protaminy (5 μg/ml), który zwiększa wydajność infekcji wirusowej. Następnie wymień medium na 10% FCS-DMEM na kolejne 2 dni.
5. Zbadaj komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki 10T1/2 zainfekowane wirusem GFP staną się GFP-dodatnie. Poddaj komórki również działaniu puromycyny (1 μg/ml) przez 5-7 dni i sprawdź, czy na płytce obecne są jakiekolwiek komórki 10T1/2 typu puro^R oraz czy tworzą one kolonie po traktowaniu puromycyną.
6. Należy zauważyć, że horyzontalny transfer genów za pośrednictwem aktywnych wirusów produkowanych przez rodzicielskie ludzkie fibroblasty gruczołu piersiowego GFP+puro^R może sprawić, że otaczające mysie komórki i/lub komórki raka w ksenoprzeszczepach nowotworowych staną się GFP+puro^R. Może to utrudnić procesy izolowania pierwotnie wstrzykniętych ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego GFP+puro^R z ksenoprzeszczepów nowotworowych.

3a. Współwstrzykiwanie ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego wraz z komórkami raka piersi myszy z niedoborem odporności

Procedury eksperymentalne służące do generowania exp-CAF przedstawiono na Rys. 1Ba.

1. Wymieszać 1x10⁶ ludzkich komórek raka piersi MCF-7-ras oraz 3x10⁶ GFP⁺puro^R unieśmiertelnionych ludzkich fibroblastów gruczołu mlekowego wytworzonych w etapie P2.2). Komórki przygotować w 400 μl pożywki hodowlanej z 50% (v/v) Matrigelu na jedną iniekcję.
2. Mieszaninę komórek wstrzyknąć podskórnie immunodeficyjnej myszy nagoj (nude mouse). W przypadku niezależnego wyodrębniania CAF z różnych guzów, każdą mieszaninę wszczepić w prawy i lewy bok kilku myszy.

3b. Iniekcja ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego do myszy z niedoborem odporności

1. Aby uzyskać fibroblasty kontrolne dla exp-CAF, przygotować 3x10⁶ unieruchomionych GFP⁺puro^R ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego wytworzonych w P2.2 w 400 μl pożywki hodowlanej z 50% (v/v) Matrigelu na jedną iniekcję (Ryc. 1Bb). NIE mieszać fibroblastów z komórkami raka.
2. Zaimplantować fibroblasty przygotowane w P3b.1 w miejsca podskórne myszy nude.

^*Należy pamiętać, że zaszczepione fibroblasty utworzą tkankę fibroblastyczną, ale nie guz pod skórą.

4a. Disekcja ksenoprzeszczepu guza

1. Uśmierć mysz z podskórnym ksenoprzeszczepem ludzkiego raka piersi 42 dni po implantacji (Rys. 1Ba). ^*Należy pamiętać, że w przypadku współimplantacji innych komórek raka i/lub fibroblastów, fibroblasty mogą wymagać inkubacji w ksenoprzeszczepie guza przez okres dłuższy niż 42 dni, aby zainicjować fenotyp miofibroblastyczny.
2. Pobierz ksenoprzeszczep guza z boku myszy poprzez rozcięcie tępe przy użyciu pęsety i nożyczek. Zanurz tkankę guza w PBS.

4b. Disekcja ksenoprzeszczepu fibroblastów

1. Poddać eutanazji mysz z wszczepionym ksenoprzeszczepem fibroblastów 42 dni po implantacji (Ryc. 1Bb).
2. Wyciąć podskórny ksenoprzeszczep fibroblastów za pomocą pęsety i nożyczek. Umieścić tkankę fibroblastyczną w PBS. ^*Należy pamiętać, że ksenoprzeszczep fibroblastów, który wygląda jak niewielka przezroczysta tkanka, może być trudny do zlokalizowania pod skórą.

5. Przygotowanie pierwotnych kultur komórek z ksenoprzeszczepów

1. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza przeprowadzić sekcję guza (˜0.5 gram) lub tkanki fibroblastycznej (˜0.1 gram). Przenieść wycięte tkanki na wierzch 15 cm naczynia hodowlanego z 1 ml PBS. Posiekać tkanki na małe fragmenty (<1.5 mm³) za pomocą sterylnych żyletek. *Uwaga: jeśli ksenoprzeszczep fibroblastów waży mniej niż 0.1 gram, należy zebrać kilka dodatkowych ksenoprzeszczepów fibroblastów i wymieszać je razem, aby zwiększyć liczbę komórek do izolacji.
2. Przenieść fragmenty tkanki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej bufor do dysocjacji komórek (10 ml na 0.5 gram tkanki) i mieszać na wstrząsacu typu vortex przez 1 min z maksymalną prędkością.
3. Inkubować zawiesinę komórkową przez 3 h w temperaturze 37°C przy ciągłym, powolnym mieszaniu.

6. Izolacja komórek opornych na puromycynę w hodowli

1. Odwiruj zawiesinę komórek uzyskanych w wyniku dysocjacji ksenograftu guza lub fibroblastów przez 5 min przy 250 X g, a następnie resuspenduj osad komórkowy w PBS. Odwiruj ponownie przez 5 min przy 250 X g. Resuspenduj otrzymany osad komórkowy w 10% FCS-DMEM. Hoduj komórki w szalce Petriego o średnicy 15 cm w obecności puromycyny (1 μg/ml) w temperaturze 37°C i przy 5% dwutlenku węgla, aby wyeliminować wszelkie zanieczyszczające komórki raka i/lub komórki zrębowe myszy. Namnażaj komórki aż do uzyskania konfluencji (2-4 tygodnie). Przechowuj komórki w temperaturze -80°C, stosując medium do mrożenia. *Należy zauważyć, że otrzymane komórki puro^R, oznaczone jako 42-dniowe exp-CAF1 (Rys. 1Ba) lub kontrolne komórki fibroblast-1 (Rys. 1Bb), są unieśmiertelnione i wykazują pozytywny wynik dla GFP. Zaleca się sprawdzenie, czy komórki te produkują aktywne wirusy, z wykorzystaniem komórek 10T1/2, zgodnie z opisem w P2.3-6.

7a. Izolacja komórek exp-CAF2 w hodowli

Aby dodatkowo wzmocnić aktywowany fenotyp miofibroblastyczny CAF-ów, wymieszaj komórki exp-CAF1 w wieku 42 dni z komórkami MCF-7-ras i wstrzyknij je ponownie podskórnie myszy nago na dodatkowy okres 200 dni. Wypreparuj i dysocjuj ksenoprzeszczep guza do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, a następnie hoduj komórki w 15 cm szalce Petriego w 10% FCS-DMEM w obecności puromycyny (1 μg/ml), zgodnie z opisem w P6.1. Namnażaj komórki aż do uzyskania konfluencji (8-10 dni). Przechowuj komórki w temperaturze -80°C w medium do mrożenia. Otrzymane komórki puro^R nazwano komórkami exp-CAF2 w wieku 242 dni (Rys. 1Ba).

7b. Ekstrakcja kontrolnych komórek fibroblastów-2 w hodowli

Aby wygenerować fibroblasty kontrolne przeciwko komórkom exp-CAF2, wstrzyknąć podskórnie myszy nude same 42-dniowe komórki kontrolne fibroblast-1, bez komórek raka, na kolejne 200 dni. Wypreparować i zdysocjować tkankę fibroblastyczną do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, a następnie hodować komórki w 15 cm szalce Petriego w pożywce 10% FCS-DMEM z dodatkiem puromycyny (1 μg/ml), zgodnie z opisem w P6.1. Namnażać komórki aż do uzyskania konfluencji (3-4 tygodnie). Przechowywać komórki w temperaturze -80°C w medium do zamrażania. Otrzymane komórki puro^R nazwano komórkami kontrolnymi fibroblast-2 (Rys. 1Bb).

8. Reprezentatywne wyniki:

Kontrolne komórki fibroblast-2 oraz komórki exp-CAF2, wyizolowane z ksenoprzeszczepów guzów piersi, wykazały silne barwienie dodatnie dla markerów mezenchymalnych, w tym dla specyficznej dla człowieka vimentyny, prolylo-4-hydroksylazy, kolagenu 1A, fibronektyny, S100A4 oraz białka powierzchniowego fibroblastów (Rys. 2A)¹¹, co wskazuje na ludzkie pochodzenie i naturę mezenchymalną tych komórek. Z kolei cytokeratyna, będąca markerem komórek nabłonkowych, nie uległa zabarwieniu w tych fibroblastach GFP⁺ (Rys. 2B). Wyniki te sugerują zatem, że wyizolowane komórki exp-CAF2 i kontrolne fibroblast-2 pochodzą od rodzicielskich ludzkich fibroblastów gruczołu mlekowego, które zostały pierwotnie wprowadzone do ksenoprzeszczepów mysich.

Co istotne, większa proporcja komórek exp-CAF2 wykazała pozytywne barwienie na α-SMA oraz glikoproteinę macierzy zewnątrzkomórkowej tenascynę-C⁵, które są markerami miofibroblastów, w porównaniu do 42-dniowych komórek exp-CAF1 i kontrolnych fibroblastów-2 (Ryc. 2C, D)¹¹. Dane te wskazują, że rezydentne ludzkie fibroblasty piersi stopniowo przekształcają się w miofibroblasty CAF w ksenoprzeszczepach nowotworowych.

Rycina 1 Schematyczne przedstawienie izolacji ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego. A) Tkankę pobraną podczas plastyki redukcyjnej piersi posiekano przy użyciu sterylnych żyletek (P1.2) i przeniesiono do stożkowej probówki o pojemności 15 ml (P1.3). Małe fragmenty tkanki poddano trawieniu w buforze do dysocjacji komórek (P1.4) i przygotowano do hodowli in vitro (P1.5-7). W celu unieśmiertelnienia wyizolowanych pierwotnych ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego wprowadzono retrowirusowy wektor pMIG (MSCV-IRES-GFP), wykazujący ekspresję zarówno hTERT, jak i GFP, a otrzymane komórki GFP-dodatnie posortowano za pomocą cytometrii przepływowej (P2.1). Następnie do tych komórek wprowadzono retrowirusowy wektor pBabe-puro kodujący gen oporności na puromycynę. Po traktowaniu puromycyną wyizolowano unieśmiertelnione ludzkie fibroblasty gruczołu piersiowego znakowane GFP (GFP⁺) i oporne na puromycynę (Puro^R) (P2.2).

Ba) W celu generowania exp-CAF, GFP⁺puro^R unieśmiertelnione ludzkie fibroblasty gruczołu piersiowego wstrzyknięto wspólnie z komórkami raka piersi MCF-7-ras podskórnie niedoborowej immunologicznie myszy nagi (P3a). Ksenoprzeszczep nowotworu wycięto w 42. dniu po implantacji (P4a) i rozdzielono do postaci zawiesiny pojedynczych komórek (P5). Komórki te hodowano następnie in vitro w obecności puromycyny, aby wyeliminować wszelkie zanieczyszczające komórki raka oraz komórki zrębu mysiego (P6). Powstałe komórki oporne na puromycynę nazwano eksperymentalnie generowanymi komórkami CAF1 (exp-CAF1). Komórki te, wycięte 42 dni po implantacji, ponownie zmieszano z komórkami MCF-7-ras i wszczepiono podskórnie myszy biorcy w taki sam sposób jak wcześniej (P7a). Powstały nowotwór pozostawiono do wzrostu na dodatkowe 200 dni, a następnie wypreparowano, rozdzielono i hodowano w obecności puromycyny. Wyizolowane komórki oporne na puromycynę nazwano komórkami exp-CAF2 (w wieku 242 dni).

Bb)W celu wyizolowania komórek kontrolnych w zestawieniu z exp-CAF, unieśmiertelnione fibroblasty gruczołu piersiowego człowieka GFP⁺puro^R wstrzyknięto podskórnie myszy nude jako czyste hodowle, bez komórek MCF-7-ras (P3b). Tkankę włóknistą, pobraną drogą chirurgiczną 42 dni po implantacji (P4b), poddano dysocjacji do zawiesiny pojedynczych komórek (P5), a następnie wyizolowano komórki oporne na puromycynę, nazwane komórkami kontrolnymi fibroblast-1, zgodnie z wcześniejszym opisem (P6). Fibroblasty te ponownie wszczepiono podskórnie myszy nude, ponownie bez dodatku komórek MCF-7-ras, na okres 200 dni (P7b). Tkankę włóknistą pobrano, poddano dysocjacji i hodowli w obecności puromycyny. Wyizolowane komórki oporne na puromycynę nazwano komórkami kontrolnymi fibroblast-2 (wiek 242 dni).

Rysunek 2 Exp-CAF oraz fibroblasty kontrolne pochodzą z macierzystych ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego. (A) Analiza immunofluorescencyjna komórek fibroblastów kontrolnych-2 (control f.) oraz exp-CAF2. Oba typy komórek wykazują dodatnie barwienie dla markerów mezenchymalnych (czerwony), w tym ludzkiej wimentyny, prolyl-4-hydroksylazy, kolagenu 1A, fibronektyny, S100A4 oraz białka powierzchniowego fibroblastów. (B) W przeciwieństwie do nich, pan-cytokeratyna, marker komórek nabłonkowych, nie jest wykrywana w komórkach exp-CAF2 wykazujących ekspresję GFP (zielony). Jądra komórkowe zabarwiono 4'-6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) (niebieski). Pasek skali, 50 μm (za Kojima et al.¹¹)

(C) Immunofluorescencja komórek exp-CAF2 oraz kontrolnych fibroblastów-2 (control f.) z użyciem przeciwciał przeciwko α-SMA (czerwony) lub tenascynie-C (TN-C) (czerwony). Jądra komórkowe są barwione DAPI (niebieski). Pasek skali, 50 μm. (D) 48% komórek exp-CAF2 wykazuje pozytywne barwienie na α-SMA, podczas gdy 14% populacji 42-dniowych komórek exp-CAF1 oraz 2,5% populacji kontrolnych fibroblastów-2 jest pozytywnych na α-SMA. (źródło: Kojima et al.11)

Dyskusja

Brak markerów specyficznych dla CAF oraz poziom heterogeniczności obserwowany wśród tych komórek sprawiają, że charakterystyka tego typu komórek stanowi samo w sobie wyzwanie. Badania nad CAF in vitro były dodatkowo utrudnione przez fakt, że komórki te ulegają starzeniu i przestają proliferować podczas długotrwałej hodowli. Nasza poprzednia próba bezpośredniej immortalizacji pierwotnych CAF z użyciem retrowirusowej konstrukcji cDNA hTERT zakończyła się niepowodzeniem. Aby zatem dalej badać właściwości pronowotwo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Invitrogen	61965-026
Surowica z płodu cielęcego	GIBCO, firmy Life Technologies	10270
Penicylina-streptomycyna	Invitrogen	15140-122
Kolagenaza typu I	Sigma-Aldrich	C0130-1G
hialuronidaza	Sigma-Aldrich	H4272
Przeciwciało przeciwko wimentynie (V9)	Novocastra Laboratories	NCL-L- VIM-V9
Przeciwciało przeciwko tenascynie C (BC-8)			uprzejmie otrzymany od dr Luciano Zardi
αprzeciwciało -SMA-Cy3 (1A4)	Sigma-Aldrich	C6198
Prolilo-4-hydroksylaza	Dako	M0877
przeciwciało (5B5)
Przeciwciało przeciwko kolagenowi typu 1 1A	Sigma-Aldrich	HPA011795
Przeciwciało przeciwko pankytokeratynie	Sigma-Aldrich	C5992
Przeciwciało przeciwko fibronektynie	BD Biosciences	610077
S100A4/FSP-1 (białko specyficzne dla fibroblastów- przeciwciało przeciwko białku specyficznemu 1 (specific protein-1)	Dako	A5114
Białko powierzchniowe fibroblastów przeciwciało (klon 1B10)	Abcam	ab11333
konstrukt MSCV-IRES-GFP			Prośba do autorów
konstrukt pBabe-puro			Zakup z Addgene
Puromycyna	Sigma-Aldrich	P8833
DAPI	Sigma-Aldrich	D9564
probówka stożkowa 15 ml	Corning	430766
Myszy nago (myszy nude)	Taconic	NCRNU-F	Samice myszy NCr nude
komórki C3H/10T1/2	ATCC		CCL-226