Obrazowanie receptorów estrogenowych $\alpha$ w tętniczkach oplątwowych szczura przy użyciu cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego

Podsumowanie

Celem niniejszego artykułu jest zaprezentowanie metody optymalizacji detekcji immunofluorescencyjnej receptora estrogenowego α (ERα) w skrawkach tętnic oponowych szczura przy użyciu cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego.

Streszczenie

Wiele efektów estrogenu na reaktywność naczyniową jest przekazywanych poprzez oddziaływanie z receptorami estrogenowymi ^{1, 2, 3}. Chociaż istnieją dwa podtypy (receptor estrogenowy -α i β), receptor estrogenowy-α został zidentyfikowany zarówno w mięśniach gładkich, jak i w komórkach śródbłonka segmentów tętnic oponowych przy użyciu barwienia fluorescencyjnego w połączeniu z konfokalną skaningową mikroskopią laserową ⁴. Ponadto ER-α znajduje się w jądrach i cytoplazmie tętnic podstawy u szczura ⁵. Receptory są liczne i intensywnie fluorescują, jednak wyraźna wizualizacja poszczególnych grup receptorów jest utrudniona, prawdopodobnie ze względu na ich liczbę w wielu warstwach komórkowych segmentów naczyń oponowych. Dodatkowo wiele doniesień wykorzystujących techniki immunohistochemiczne w połączeniu z mikroskopią konfokalną słabo opisuje wymagania krytyczne dla powtarzalności eksperymentów ⁶. Celem niniejszego artykułu jest opis prostej techniki optymalizacji barwienia i wizualizacji ER-α przy użyciu przekrojów poprzecznych tętniczek oponowych pobranych z mózgów samic szczura. W pierwszej kolejności przeprowadzamy perfuzję szczurów barwnikiem błękitem Ewansa, aby łatwo zidentyfikować powierzchniowe tętnice oponowe, które izolujemy pod mikroskopem operacyjnym. Użycie kriotomatu do wycięcia przekrojów poprzecznych tętnic o grubości 8 μm pozwala na uzyskanie cienkich sekcji naczyń, dzięki czemu różne płaszczyzny naczyniowe są wyraźniej widoczne. Cięcie w poprzek naczynia, zamiast stosowania małego segmentu naczynia, daje korzyść w postaci łatwiejszego oglądu warstw śródbłonka i mięśni gładkich. Ponadto zastosowanie cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego z oprogramowaniem do rozszerzonej głębi ostrości pozwala na uzyskanie wyraźnych obrazów od dziesięciu do dwunastu różnych płaszczyzn naczyniowych i jest mniej kosztowne niż użycie konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.

Protokół

1. Izolacja i przygotowanie tętnic oponowych

1. Podczas znieczulenia szczura wprowadź i zabezpiecz cewnik w tętnicy, a następnie przeprowadź perfuzję 1% roztworem błękitu Evansa w 1X PBS. Naczynia oponowe dobrze barwią się błękitem Evansa, co ułatwia ich izolację.
2. Wyjmij mózg i przechowuj w temperaturze -70°C do momentu użycia. Optymalnie mózgi nie powinny być przechowywane dłużej niż 2 miesiące.
3. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego usuń tętniczki oponowe (średnica średnia 35-50 μm) z powierzchni mózgu. Ostrożnie odseparuj wszystkie zabarwione na niebiesko tętniczki z grzbietowej i bocznej powierzchni kory, używając pęsety z cienkimi końcówkami. Usuń nadmiar przylegającej tkanki korowej przed umieszczeniem w utrwalaczu.
4. Utrwal pobrane tętniczki w 2% zimnej paraformaldehydzie w 0,1M PBS przez 30 min.
5. Aby przygotować tętniczki do krojenia, wlej medium do zatapiania na dysk mrożący/adapter (ustawiony na -20°C).
6. Umieść odcinek tętniczki płasko na adapterze i poczekaj, aż zamarznie. Mocno ustaw naczynie pionowo na dysku mrożącym kriotomu w medium do zatapiania, tak aby koniec tętnicy był skierowany w Twoją stronę. Przytrzymaj go pęsetą, aż całkowicie zamarznie.
7. Umieść dysk mrożący z naczyniem w głowicy kriotomu i wytnij pierścienie tętniczek oponowych o grubości 8 μm.
8. Nanieś przekroje tętniczek na szkiełka pokryte żelatyną chromowo-potasową.
9. Przechowuj przygotowane szkiełka w pudełku w lodówce w temperaturze 4°C przez noc.

2. Barwienie immunofluorescencyjne ER-α

Dzień 1

1. Wyjmij preparaty ze słodziarki; doprowadź każdy z nich do temperatury pokojowej.
2. Aby umyć preparaty, wlej 1-1,5 ml 0,1M PBS (ilość wystarczająca do pokrycia wszystkich przekrojów), pozostaw na 10 minut, zlej płyn i powtórz tę procedurę jeszcze dwukrotnie. Każda krawędź szkiełka posiada marker hydrofobowy, dzięki czemu ciecz pozostaje na powierzchni preparatu. Podczas każdego mycia ciecz jest wylewana i zastępowana świeżym 0,1 M PBS.
3. Inkubuj preparaty w 1 ml 50mM chlorku amonu przez 30 min w temperaturze pokojowej w celu redukcji fluorescencji endogennej.
4. Umyj preparaty w 0,1M PBS 3x10 min, zgodnie z opisem w punkcie 2.2.
5. Zablokuj preparaty w 0,1% Triton-X 100 oraz 1% normalnego serum koziego (NGS) w PBS przez 30 min, aby zredukować wiązania nieswoiste.
6. Inkubuj próbki z przeciwciałem pierwszorzędowym (rabbit polyclonal anti-ER-α; 1:500) w PBS + 0,1% Triton-X + 1% NGS przez noc w temperaturze 4°C.

Dzień 2

7. Wyjąć preparaty z lodówki i doprowadzić każdy z nich do temperatury pokojowej.
8. Przemyć preparaty w 0,1M PBS 3x10 min. zgodnie z opisem w punkcie 2.2
9. Inkubować z przeciwciałem wtórnym anty-króliczym Oregon Green 488 w 1% NGS +0,1% Triton-X100 + PBS przez 2 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej. Od tego momentu wszystkie kolejne kroki muszą być wykonywane w ciemności.
10. Przemyć preparaty w 0,1M PBS 3x10 min. zgodnie z opisem w punkcie 2.2
11. Pod wyciągiem nałożyć 1 kroplę 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) wraz z medium montażowym na naczynia, a następnie przykryć próbkę szkiełkiem cover slip.
12. Zabezpieczyć krawędzie szkiełka bezbarwnym lakierem do paznokci. Nie przesuwać preparatów aż do całkowitego wyschnięcia, co trwa około 24 godzin.

3. Cyfrowe obrazowanie fluorescencyjne

1. Do obrazowania ER-α w przekroju naczynia oponowego wykorzystujemy cyfrowy mikroskop fluorescencyjny Nikon Eclipse 80i z filtrami dla 3 kolorów (niebieskiego, zielonego i czerwonego), wyposażony w kamerę cyfrową.
2. Umieszczamy przygotowane preparaty z zabarwionymi segmentami naczyń oponowych pod mikroskopem i regulujemy ustawienia, aby zwizualizować fluorescencyjnie znakowane obszary zainteresowania. Rozpoczynamy od powiększenia x100, a następnie zwiększamy je do x600.
3. Za pomocą kamery rejestrujemy obrazy w kanałach DAPI (niebieskim) i FITC (zielonym) dla jąder komórkowych (DAPI) oraz ER-α (Oregon Green), wykorzystując oprogramowanie Nikon Extended Depth Focus do konwersji wielu widoków segmentów naczyń w obrazy 2-D.

4. Reprezentatywne wyniki:

Zlokalizowaliśmy receptor estrogenowy-α w naczyniach tętniczych oponopławnych przy użyciu sond fluorescencyjnych i zoptymalizowaliśmy wizualizację receptora za pomocą cyfrowej mikroskopii fluorescencyjnej. Aby wykryć obecność receptora, do obrazowania receptorów w tętnicach oponopławnych wyizolowanych z powierzchni mózgu zastosowano królika poliklonalne przeciwciało pierwszorzędowe oraz przeciwciało drugorzędowe znakowane Oregon Green 488. Użyto również barwnika jądrowego (DAPI) w celu identyfikacji jąder komórkowych i ustalenia, czy możliwe jest wykrycie receptorów znajdujących się w jądrze, ponieważ doniesiono, że ER-α występuje w cytozolu oraz w jądrze komórkowym. Dodatkowo przeprowadzono eksperymenty potwierdzające w celu walidacji specyficzności przeciwciała pierwszorzędowego oraz weryfikacji wiązania przeciwciała drugorzędowego z pierwszorzędowym.

Rycina 1. Barwienie immunofluorescencyjne dla ER- α (zielony) i przeciwbarwienie DAPI (niebieski) w pierścieniu tętnicy pialnej wyizolowanym z mózgu samicy szczura. Ryc. 1A przedstawia nałożone obrazy sugerujące obecność części receptorów estrogenowych-a wewnątrzjądrowych (strzałka). Ryc. 1B i 1C to obrazy ER- α w powiększeniu, stanowiące kombinację obrazów ze stosu Z (Z-stack). Obrazy wykonano przy powiększeniu x600; pochodzą one z przekrojów pierścienia tego samego naczynia w różnych płaszczyznach. Strzałki wskazują receptor estrogenowy- α.

Rysunek 2. Barwienie immunofluorescencyjne grup kontrolnych w pierścieniu tętnicy pialnej wyizolowanej z mózgu samicy szczura. Rys. 2D przedstawia naczynie bez przeciwciała pierwszorzędowego. Rys. 2E przedstawia naczynie bez przeciwciała drugorzędowego (zwróć uwagę na wyraźną autofluorescencję wzdłuż strony śródbłonka). Obrazy wykonano przy powiększeniu x600 i pochodzą z przekroju pierścienia tego samego naczynia w różnych płaszczyznach.

Dyskusja

Wcześniej wykazaliśmy, że po przejściowym globalnym niedokrwiennym uszkodzeniu mózgu zdolność tętnic oponowych do zmiany średnicy w odpowiedzi zarówno na wazodylatatory ^{7, 8}, jak i wazokonstryktory ⁹ jest znacznie obniżona u młodych szczurów po owariektomii. Przewlekłe uzupełnianie estrogenów przywraca odpowiedzi naczynioryżowe ^7-9. Co więcej, opóźnione uzupełnianie estrogenów znosi korzystny wpływ estrogenów na zdolność wazodylatacyjną tętnic oponowych ¹⁰, co skłoniło nas do postawienia pytania, czy długotrwały niedobór estrogenów wpływa na gęstość ER-α w naczyniach mózgowych. Zaplanowaliśmy wykorzystanie znakowania immunofluorescencyjnego w połączeniu z western blottingiem w celu oceny zmian w ekspresji ER-α w odpowiedzi na przewlekły niedobór estrogenów. Ze względu na trudności z wizualizacją pojedynczych grup receptorów zmodyfikowaliśmy metodę, którą tutaj prezentujemy. Dlatego głównym celem niniejszego badania było przede wszystkim opracowanie stosunkowo prostej metody optymalizacji wizualizacji receptorów w arteriolach oponowych. Zgodnie z kilkoma doniesieniami ^6,11,12 uznaliśmy za konieczne wprowadzenie korekt w zależności od rodzaju badanej tkanki, grubości próbki, rozmieszczenia ER-α w naczyniu, a także stopnia nieswoistego wiązania.

Nasza metoda jest bardzo skuteczna w wizualizacji obecności ER-α w skrawkach naczyń pialnych. Jednak, jak wcześniej wskazywali inni autorzy, pomyślne zastosowanie tych metod jest w dużej mierze zależne od specyfiki i stężeń przeciwciał, lokalizacji subkomórkowej badanych białek, protokołów fiksacji i blokowania oraz sposobu obchodzenia się z tkanką ¹². Przed wizualizacją naszych preparatów naczyniowych poświęciliśmy czas na dopracowanie wszystkich tych zmiennych. W niniejszej pracy podkreśliliśmy, w jaki sposób musieliśmy dostosować niektóre elementy naszego podejścia.

Naszym celem była optymalna wizualizacja ER-α w tętniczkach oplotowych, co wiązało się z kilkoma wyzwaniami. Po pierwsze, średnia średnica tętnicy oplotowej szczura wynosi od 35-50 μm, co sprawia, że ich izolacja i usuwanie z powierzchni mózgu jest dość trudne. Stwierdziliśmy, że perfuzja barwnikiem błękitem Evansa przed ubojem ułatwia preparowanie tętnic. Błękit Evansa może wpływać na fluorescencję, jednak uważamy, że korzyści z zastosowania tego barwnika przeważają nad jego niewielkimi wadami. W naszym protokole naczynia są płukane kilkukrotnie. Minimalizuje to ilość pozostałego w naczyniach barwnika i ogranicza jego potencjalny wpływ na fluorescencję. Inną napotkaną trudnością była grubość segmentów naczyń oplotowych, która utrudniała wyraźną wizualizację receptorów. Dodatkowo nie mogliśmy uzyskać szczególnie ostrych obrazów, prawdopodobnie ze względu na fakt, że ER-α były rozproszone w kilku warstwach komórkowych. Próbowaliśmy pracować na podłużnych przekrojach naczyń (podobnie jak inni), ale ze względu na mały rozmiar naczyń oplotowych trudna była manipulacja nimi oraz zapobieganie ich skręcaniu podczas montowania na szkiełkach, nawet przy użyciu mikroskopu. Ostatecznie z sukcesem zmodyfikowaliśmy naszą technikę, wykorzystując kriostat i wykonując przekroje poprzeczne naczyń w postaci pierścieni o grubości 8 μm. Pierścienie te są łatwiejsze w manipulacji, a kilka z nich można zamontować na jednym szkiełku.

Po pozyskaniu naczyń uznaliśmy za konieczne sprawdzenie skuteczności metody polegającej na najpierw błyskawicznym zamrażaniu tkanki, a następnie utrwalaniu naczyń, zgodnie z sugestią Danseshatalb i współpracowników ¹¹. Chociaż zaobserwowaliśmy nieznacznie mniejszą immunofluorescencję tła, odnotowaliśmy również, że receptory barwiły się mniej intensywnie, co utrudniało ich wizualizację. W związku z tym preferujemy najpierw zamrozić cały mózg i przechowywać go do czasu użycia (zazwyczaj od 1 do 2 miesięcy). Następnie wyodrębniamy naczynia w opisany sposób i utrwalamy je przed krojeniem w kriotomie, co demonstrujemy w niniejszym materiale.

Niezbędnym krokiem jest przeprowadzenie kontroli z użyciem osobno przeciwciała pierwszorzędowego i drugorzędowego, aby określić specyficzność oraz tło immunofluorescencji. Przeciwciała przeciwko receptorowi estrogenowemu-α mogą być trudne w zastosowaniu. W rzeczywistości przetestowaliśmy 3 różne przeciwciała pierwszorzędowe (1 monoklonalne i 2 poliklonalne), zanim uzyskaliśmy satysfakcjonujące wyniki barwienia receptorów. W ramach kontroli najpierw zweryfikowaliśmy specyficzność przeciwciała pierwszorzędowego poprzez pominięcie jego dodania. Rysunek 2D przedstawia naczynie bez przeciwciała pierwszorzędowego. Nie obserwuje się barwienia, a jedynie niewielki sygnał tła. Ponieważ przeciwciało pierwszorzędowe jest poliklonalne, występuje pewne rozproszone, niespecyficzne barwienie tła. Następnie dodaliśmy przeciwciało pierwszorzędowe, ale nie dodaliśmy przeciwciała drugorzędowego (Rys. 2E). Można zauważyć wyraźny margines reprezentujący autofluorescencję wzdłuż brzegów śródbłonka naczyń. Jest to zgodne z pracami Dana i współpracowników ⁵. Jednak ani małe punkty immunofluorescencji reprezentujące ER-α, ani ziarnisty wygląd odzwierciedlający obecność licznych receptorów nie są wykrywalne bez jednoczesnego zastosowania przeciwciała pierwszorzędowego i drugorzędowego. Odnotowaliśmy wyraźny wzorzec autofluorescencji wzdłuż marginesów śródbłonka naczyń. Te niezależne testy specyficzności przeciwciał są istotne, ponieważ potwierdzają specyficzność przeciwciała względem ER-α oraz wiązanie przeciwciała drugorzędowego z pierwszorzędowym.

Podsumowując, jak wykazali inni ^{4, 5}, naczynia krwionośne mózgu zawierają liczne receptory podtypu ER-α. W naszych badaniach przygotowanie przekrojów o grubości 8μm z wyizolowanych tętnic oplotkowych poprawia barwienie i wizualizację receptorów. Tradycyjne metody wykorzystują mikroskopię konfokalną do badania próbek. Możliwość oglądania seryjnych przekrojów optycznych z grubych preparatów jest istotną zaletą mikroskopii konfokalnej. Jednak zakup wysokiej klasy mikroskopu konfokalnego może być bardzo kosztowny. Stwierdziliśmy, że zastosowanie oprogramowania Extended Depth (EDF) może obniżyć koszty wyposażenia. Używając mikroskopu fluorescencyjnego z funkcją EDF, uzyskaliśmy wyraźne obrazy i jesteśmy w stanie wizualizować ER-α w tętnicach oplotkowych na kilku poziomach przy użyciu stosów Z (Z-stacks). Istotną zaletą oprogramowania EDF jest to, że umożliwia ono przechwytywanie obrazów w sposób, który pozwala na efektywne stworzenie obrazu 3D z poszczególnych zdjęć. Dla laboratoriów, które nie mają dostępu do mikroskopu konfokalnego lub funduszy na jego zakup, cyfrowy mikroskop fluorescencyjny z odpowiednim oprogramowaniem może być praktyczną i mniej kosztowną opcją, w zależności od celów badacza.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BŁĘKIT EWANSA	Sigma-Aldrich	E-2129
PBS 10X	Sigma-Aldrich	P-5493
Paraformaldehyd	Fisher Scientific	T353
Związek Tissue-Tek O.C.T	VWR international	25608-930
Chlorek amonu	Sigma-Aldrich	A9434
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Normalne surowica kozia	Invitrogen	16210-064
Królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko ER-α	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	H-184
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG Oregon green 488	Invitrogen	O-11038
Medium montażowe Vectashield do fluorescencji z DAPI	Vector Laboratories	H-1200