Obrazowanie receptorów estrogenowych $\alpha$ w tętniczkach oplątwowych szczura przy użyciu cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego

Podsumowanie

Celem niniejszego artykułu jest zaprezentowanie metody optymalizacji detekcji immunofluorescencyjnej receptora estrogenowego α (ERα) w skrawkach tętnic oponowych szczura przy użyciu cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego.

Streszczenie

Wiele efektów estrogenu na reaktywność naczyniową jest przekazywanych poprzez oddziaływanie z receptorami estrogenowymi ^{1, 2, 3}. Chociaż istnieją dwa podtypy (receptor estrogenowy -α i β), receptor estrogenowy-α został zidentyfikowany zarówno w mięśniach gładkich, jak i w komórkach śródbłonka segmentów tętnic oponowych przy użyciu barwienia fluorescencyjnego w połączeniu z konfokalną skaningową mikroskopią laserową ⁴. Ponadto ER-α znajduje się w jądrach i cytoplazmie tętnic podstawy u szczura ⁵. Receptory są liczne i intensywnie fluorescują, jednak wyraźna wizualizacja poszczególnych grup receptorów jest utrudniona, prawdopodobnie ze względu na ich liczbę w wielu warstwach komórkowych segmentów naczyń oponowych. Dodatkowo wiele doniesień wykorzystujących techniki immunohistochemiczne w połączeniu z mikroskopią konfokalną słabo opisuje wymagania krytyczne dla powtarzalności eksperymentów ⁶. Celem niniejszego artykułu jest opis prostej techniki optymalizacji barwienia i wizualizacji ER-α przy użyciu przekrojów poprzecznych tętniczek oponowych pobranych z mózgów samic szczura. W pierwszej kolejności przeprowadzamy perfuzję szczurów barwnikiem błękitem Ewansa, aby łatwo zidentyfikować powierzchniowe tętnice oponowe, które izolujemy pod mikroskopem operacyjnym. Użycie kriotomatu do wycięcia przekrojów poprzecznych tętnic o grubości 8 μm pozwala na uzyskanie cienkich sekcji naczyń, dzięki czemu różne płaszczyzny naczyniowe są wyraźniej widoczne. Cięcie w poprzek naczynia, zamiast stosowania małego segmentu naczynia, daje korzyść w postaci łatwiejszego oglądu warstw śródbłonka i mięśni gładkich. Ponadto zastosowanie cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego z oprogramowaniem do rozszerzonej głębi ostrości pozwala na uzyskanie wyraźnych obrazów od dziesięciu do dwunastu różnych płaszczyzn naczyniowych i jest mniej kosztowne niż użycie konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.

Protokół

1. Izolacja i przygotowanie tętnic oponowych

1. Podczas znieczulenia szczura wprowadzić i zabezpieczyć kaniulę do tętnicy, a następnie przeprowadzić perfuzję 1% Evans blue w 1X PBS. Naczynia oponowe dobrze barwią się barwnikiem Evans blue, co ułatwia ich izolację.
2. Wyjąć mózg i przechowywać w temperaturze -70°C do momentu użycia. Optymalnie mózgi nie powinny być przechowywane dłużej niż 2 miesiące.
3. Za pomocą mikroskopu sekcyjnego usunąć tętniczki oponowe (średnica średnio 35-50 μm) z powierzchni mózgu. Ostrożnie odseparować wszystkie zabarwione na niebiesko tętniczki z grzbietowej i bocznej powierzchni kory, używając pęsety z cienkimi końcami. Usunąć nadmiar przylegającej tkanki korowej przed umieszczeniem w utrwalaczu.
4. Utrwalić pobrane tętniczki w 2% zimnej paraformaldehydzie w 0,1M PBS przez 30 min.
5. Aby przygotować tętniczki do krojenia, nalać medium do zatopienia na dysk/uchwyt mrożący (ustawiony na -20°C).
6. Umieścić fragment tętniczki płasko na uchwycie i poczekać, aż zamarznie. Mocno ustawić naczynie pionowo na dysku mrożącym kriotomu w medium do zatopienia, tak aby koniec tętnicy był skierowany w stronę operatora. Przytrzymać pęsetą do czasu całkowitego zamrożenia.
7. Umieścić dysk mrożący z naczyniem w głowicy kriotomu i wyciąć pierścienie tętniczek oponowych o grubości 8 μm.
8. Zamontować przekroje tętniczek na szkiełkach pokrytych żelatyną chromowo-potasową.
9. Przechowywać przygotowane szkiełka w kasecie w lodówce w temperaturze 4°C przez noc.

2. Barwienie immunofluorescencyjne ER-α

Dzień 1

1. Wyjąć preparaty ze środka chłodniczego i doprowadzić każdy z nich do temperatury pokojowej.
2. Aby przemyć preparaty, nalać 1-1,5 ml 0,1M PBS (ilość wystarczająca do pokrycia wszystkich przekrojów), pozostawić na 10 minut, odlać i powtórzyć procedurę jeszcze dwukrotnie. Każda krawędź preparatu posiada marker hydrofobowy, dzięki czemu ciecz pozostaje na powierzchni szkiełka. Podczas każdego płukania ciecz jest odlewana i zastępowana świeżym 0,1M PBS.
3. Inkubować preparaty w 1 ml 50mM chlorku amonu przez 30 min w temperaturze pokojowej w celu zmniejszenia autofluorescencji.
4. Przemyć preparaty w 0,1M PBS 3x10 min zgodnie z opisem w punkcie 2.2.
5. Zablokować preparaty w 0,1% Triton-X 100 oraz 1% normalnego surowicy koziej (NGS) w PBS przez 30 min, aby zredukować niespecyficzne wiązanie.
6. Inkubować próbki z przeciwciałem pierwotnym (królicze poliklonalne anty-ER-α; 1:500) w PBS + 0,1% Triton-X + 1% NGS przez noc w temperaturze 4°C.

Dzień 2

7. Wyjmij preparaty ze słoika z lodówki; doprowadź każdy z nich do temperatury pokojowej.
8. Przemyj preparaty w 0,1M PBS 3x10 min. zgodnie z opisem w punkcie 2.2
9. Inkubuj z wtórnym przeciwciałem antykróliczym Oregon Green 488 w 1% NGS + 0,1% Triton-X100 + PBS przez 2 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej. Od tego momentu wszystkie kolejne etapy muszą być wykonywane w ciemności.
10. Przemyj preparaty w 0,1M PBS 3x10 min. zgodnie z opisem w punkcie 2.2
11. Pod wyciągiem nałóż 1 kroplę 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) wraz z medium montażowym na naczynia, a następnie nałóż szkiełko nakrywkowe na próbkę.
12. Zastosuj bezbarwny lakier do paznokci, aby uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego. Nie przemieszczaj preparatów aż do całkowitego wyschnięcia, co zajmuje około 24 godzin.

3. Cyfrowa obrazowanie fluorescencyjne

1. Do obrazowania ER-α w przekroju naczynia oponowe wykorzystujemy cyfrowy mikroskop fluorescencyjny Nikon Eclipse 80i z filtrami dla 3 kolorów (niebieskiego, zielonego i czerwonego), wyposażony w kamerę cyfrową.
2. Umieść przygotowane preparaty z barwionymi fragmentami naczyń oponowych pod mikroskopem i wyreguluj ustawienia, aby zwizualizować fluorescencyjnie znakowane obszary zainteresowania. Rozpocznij od powiększenia x100, a następnie zwiększ je do x600.
3. Użyj kamery do wykonania zdjęć w kanałach DAPI (niebieski) i FITC (zielony) dla jąder komórkowych (DAPI) oraz ER-α (Oregon Green), wykorzystując oprogramowanie Nikon Extended Depth Focus do konwersji wielu widoków fragmentów naczyń w obrazy 2-D.

4. Reprezentatywne wyniki:

Zlokalizowaliśmy receptor estrogenowy-α w naczyniach tętniczych oponopławnych przy użyciu sond fluorescencyjnych i zoptymalizowaliśmy wizualizację receptora za pomocą cyfrowej mikroskopii fluorescencyjnej. Aby wykryć obecność receptora, zastosowano królicze poliklonalne przeciwciało pierwszorzędowe oraz przeciwciało wtórne znakowane Oregon Green 488 do obrazowania receptorów w tętnicach oponopławnych wyizolowanych z powierzchni mózgu. Wykorzystano również barwnik jądrowy (DAPI) w celu identyfikacji jąder komórkowych i ustalenia, czy możliwe jest wykrycie receptorów zlokalizowanych w jądrze, ponieważ zgłaszano obecność ER-α w cytosolu oraz w jądrze komórkowym. Dodatkowo przeprowadzono eksperymenty potwierdzające, aby zwalidować specyficzność przeciwciała pierwszorzędowego oraz zweryfikować wiązanie przeciwciała wtórnego z przeciwciałem pierwszorzędowym.

Rycina 1. Barwienie immunofluorescencyjne dla ER- α (zielony) oraz przeciwbarwienie DAPI (niebieski) w pierścieniu tętnicy pialnej wyizolowanym z mózgu samicy szczura. Ryc. 1A przedstawia nałożone obrazy sugerujące obecność receptorów estrogenowych-a wewnątrz jądra komórkowego (strzałka). Ryc. 1B i 1C to powiększone obrazy ER- α, będące kombinacją obrazów z serii Z-stack. Obrazy wykonano przy powiększeniu x600, pochodzą one z przekrojów pierścienia tego samego naczynia w różnych płaszczyznach. Strzałki wskazują receptor estrogenowy- α.

Rycina 2. Barwienie immunofluorescencyjne grup kontrolnych w pierścieniu tętnicy oplizowej wyizolowanej z mózgu samicy szczura. Ryc. 2D przedstawia naczynie bez przeciwciała pierwszorzędowego. Ryc. 2E przedstawia naczynie bez przeciwciała drugorzędowego (należy zwrócić uwagę na wyraźną autofluorescencję po stronie śródbłonka). Obrazy wykonano przy powiększeniu x600; pochodzą one z przekroju pierścienia tego samego naczynia w różnych płaszczyznach.

Dyskusja

Wcześniej wykazaliśmy, że po przejściowym globalnym niedokrwiennym uszkodzeniu mózgu zdolność tętnic oponowych do zmiany średnicy w odpowiedzi zarówno na wazodylatatory ^{7, 8}, jak i wazokonstryktory ⁹ jest znacznie obniżona u młodych szczurów po owariektomii. Przewlekłe uzupełnianie estrogenów przywraca odpowiedzi naczynioryżowe ^7-9. Co więcej, opóźnione uzupełnianie estrogenów znosi korzystny wpływ estrogenów na zdolność wazodylatacyjną tętnic oponowych ¹⁰, co skłoniło nas do postawienia pytania, czy długotrwały niedobór estrogenów wpływa na gęstość ER-α w naczyniach mózgowych. Zaplanowaliśmy wykorzystanie znakowania immunofluorescencyjnego w połączeniu z western blottingiem w celu oceny zmian w ekspresji ER-α w odpowiedzi na przewlekły niedobór estrogenów. Ze względu na trudności z wizualizacją pojedynczych grup receptorów zmodyfikowaliśmy metodę, którą tutaj prezentujemy. Dlatego głównym celem niniejszego badania było przede wszystkim opracowanie stosunkowo prostej metody optymalizacji wizualizacji receptorów w arteriolach oponowych. Zgodnie z kilkoma doniesieniami ^6,11,12 uznaliśmy za konieczne wprowadzenie korekt w zależności od rodzaju badanej tkanki, grubości próbki, rozmieszczenia ER-α w naczyniu, a także stopnia nieswoistego wiązania.

Nasza metoda jest bardzo skuteczna w wizualizacji obecności ER-α w skrawkach naczyń pialnych. Jednak, jak wcześniej wskazywali inni autorzy, pomyślne zastosowanie tych metod jest w dużej mierze zależne od specyfiki i stężeń przeciwciał, lokalizacji subkomórkowej badanych białek, protokołów fiksacji i blokowania oraz sposobu obchodzenia się z tkanką ¹². Przed wizualizacją naszych preparatów naczyniowych poświęciliśmy czas na dopracowanie wszystkich tych zmiennych. W niniejszej pracy podkreśliliśmy, w jaki sposób musieliśmy dostosować niektóre elementy naszego podejścia.

Naszym celem była optymalna wizualizacja ER-α w tętniczkach oplotowych, co wiązało się z kilkoma wyzwaniami. Po pierwsze, średnia średnica tętnicy oplotowej szczura wynosi od 35-50 μm, co sprawia, że ich izolacja i usuwanie z powierzchni mózgu jest dość trudne. Stwierdziliśmy, że perfuzja barwnikiem błękitem Evansa przed ubojem ułatwia preparowanie tętnic. Błękit Evansa może wpływać na fluorescencję, jednak uważamy, że korzyści z zastosowania tego barwnika przeważają nad jego niewielkimi wadami. W naszym protokole naczynia są płukane kilkukrotnie. Minimalizuje to ilość pozostałego w naczyniach barwnika i ogranicza jego potencjalny wpływ na fluorescencję. Inną napotkaną trudnością była grubość segmentów naczyń oplotowych, która utrudniała wyraźną wizualizację receptorów. Dodatkowo nie mogliśmy uzyskać szczególnie ostrych obrazów, prawdopodobnie ze względu na fakt, że ER-α były rozproszone w kilku warstwach komórkowych. Próbowaliśmy pracować na podłużnych przekrojach naczyń (podobnie jak inni), ale ze względu na mały rozmiar naczyń oplotowych trudna była manipulacja nimi oraz zapobieganie ich skręcaniu podczas montowania na szkiełkach, nawet przy użyciu mikroskopu. Ostatecznie z sukcesem zmodyfikowaliśmy naszą technikę, wykorzystując kriostat i wykonując przekroje poprzeczne naczyń w postaci pierścieni o grubości 8 μm. Pierścienie te są łatwiejsze w manipulacji, a kilka z nich można zamontować na jednym szkiełku.

Po pozyskaniu naczyń uznaliśmy za konieczne sprawdzenie skuteczności metody polegającej na najpierw błyskawicznym zamrażaniu tkanki, a następnie utrwalaniu naczyń, zgodnie z sugestią Danseshatalb i współpracowników ¹¹. Chociaż zaobserwowaliśmy nieznacznie mniejszą immunofluorescencję tła, odnotowaliśmy również, że receptory barwiły się mniej intensywnie, co utrudniało ich wizualizację. W związku z tym preferujemy najpierw zamrozić cały mózg i przechowywać go do czasu użycia (zazwyczaj od 1 do 2 miesięcy). Następnie wyodrębniamy naczynia w opisany sposób i utrwalamy je przed krojeniem w kriotomie, co demonstrujemy w niniejszym materiale.

Niezbędnym krokiem jest przeprowadzenie kontroli z użyciem osobno przeciwciała pierwszorzędowego i drugorzędowego, aby określić specyficzność oraz tło immunofluorescencji. Przeciwciała przeciwko receptorowi estrogenowemu-α mogą być trudne w zastosowaniu. W rzeczywistości przetestowaliśmy 3 różne przeciwciała pierwszorzędowe (1 monoklonalne i 2 poliklonalne), zanim uzyskaliśmy satysfakcjonujące wyniki barwienia receptorów. W ramach kontroli najpierw zweryfikowaliśmy specyficzność przeciwciała pierwszorzędowego poprzez pominięcie jego dodania. Rysunek 2D przedstawia naczynie bez przeciwciała pierwszorzędowego. Nie obserwuje się barwienia, a jedynie niewielki sygnał tła. Ponieważ przeciwciało pierwszorzędowe jest poliklonalne, występuje pewne rozproszone, niespecyficzne barwienie tła. Następnie dodaliśmy przeciwciało pierwszorzędowe, ale nie dodaliśmy przeciwciała drugorzędowego (Rys. 2E). Można zauważyć wyraźny margines reprezentujący autofluorescencję wzdłuż brzegów śródbłonka naczyń. Jest to zgodne z pracami Dana i współpracowników ⁵. Jednak ani małe punkty immunofluorescencji reprezentujące ER-α, ani ziarnisty wygląd odzwierciedlający obecność licznych receptorów nie są wykrywalne bez jednoczesnego zastosowania przeciwciała pierwszorzędowego i drugorzędowego. Odnotowaliśmy wyraźny wzorzec autofluorescencji wzdłuż marginesów śródbłonka naczyń. Te niezależne testy specyficzności przeciwciał są istotne, ponieważ potwierdzają specyficzność przeciwciała względem ER-α oraz wiązanie przeciwciała drugorzędowego z pierwszorzędowym.

Podsumowując, jak wykazali inni ^{4, 5}, naczynia krwionośne mózgu zawierają liczne receptory podtypu ER-α. W naszych badaniach przygotowanie przekrojów o grubości 8μm z wyizolowanych tętnic oplotkowych poprawia barwienie i wizualizację receptorów. Tradycyjne metody wykorzystują mikroskopię konfokalną do badania próbek. Możliwość oglądania seryjnych przekrojów optycznych z grubych preparatów jest istotną zaletą mikroskopii konfokalnej. Jednak zakup wysokiej klasy mikroskopu konfokalnego może być bardzo kosztowny. Stwierdziliśmy, że zastosowanie oprogramowania Extended Depth (EDF) może obniżyć koszty wyposażenia. Używając mikroskopu fluorescencyjnego z funkcją EDF, uzyskaliśmy wyraźne obrazy i jesteśmy w stanie wizualizować ER-α w tętnicach oplotkowych na kilku poziomach przy użyciu stosów Z (Z-stacks). Istotną zaletą oprogramowania EDF jest to, że umożliwia ono przechwytywanie obrazów w sposób, który pozwala na efektywne stworzenie obrazu 3D z poszczególnych zdjęć. Dla laboratoriów, które nie mają dostępu do mikroskopu konfokalnego lub funduszy na jego zakup, cyfrowy mikroskop fluorescencyjny z odpowiednim oprogramowaniem może być praktyczną i mniej kosztowną opcją, w zależności od celów badacza.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BŁĘKIT EWANSA	Sigma-Aldrich	E-2129
PBS 10X	Sigma-Aldrich	P-5493
Paraformaldehyd	Fisher Scientific	T353
Związek Tissue-Tek O.C.T	VWR international	25608-930
Chlorek amonu	Sigma-Aldrich	A9434
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Normalne surowica kozia	Invitrogen	16210-064
Królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko ER-α	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	H-184
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG Oregon green 488	Invitrogen	O-11038
Medium montażowe Vectashield do fluorescencji z DAPI	Vector Laboratories	H-1200